- وسترن بلات با بهره گرفتن از سرم میکس (Pool sera) افراد آلوده به عفونت توکسوپلاسموز
۳-۲-۱- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE
الکتروفورز روی ژل پلی آکریل آمید حاوی SDS یک روش کم هزینه ،سریع و قابل تکرار در مطالعه پروتئین است. این روش به طور متداول برای بررسی مراحل خالص سازی ،محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن ملکولی پروتئین ها و پپتیدها بکار می رود . در ضمن با انجام روش بلاتینگ بعد از آن ، امکان بررسی آنتی ژنیسیته یا تعیین توالی پروتئینها و پپتیدها فراهم می شود . این روش را می توان با هدف خالص سازی مقادیر کم

پروتئین ها نیز بکار برد . بدین لحاظ امروزه SDS-PAGEبه عنوان پراستفاده ترین روش در میان روش های الکتروفورزی مطرح است. قابلیت تفکیک کنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتا” ناشی از وجود
سدیم دودسیل سولفات و ویژگی مناسب ژل پلی آکریل آمید در غربال پروتئین های مختلف است .SDS با اتصال به پروتئین ها بار طبیعی آنها را می پوشاند و بار منفی با تراکم تقریبا” مشابهی در ملکول ظاهر می سازد . جداسازی پروتئین ها در این شرایط وابسته به اندازه ملکولی و نتیجه اثر غربالگری ژل پلی آکریل آمید است و با توجه به اندازه منافذ ژل حرکت پروتئینهای کوچک تر با مزاحمت کمتر و حرکت پروتئین های بزرگتر با مزاحمت بیشتری همراه است. فاصله طی شده توسط پروتئین ها در پایان الکتروفورز با وزن ملکولی آنها متناسب است و این موضوع اساس تعیین وزن ملکولی را در روش SDS-PAGE تشکیل می دهد .
مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE
- آکریل آمید ۳۰%(۵۰ میلی لیتر)
آکریل آمید Sigma 30 گرم
بیس-آکریل آمید Sigma 8/0 گرم
در آب مقطر حل شده پس از به حجم رساندن در ºC4 و دور از نور نگهداری شد.
- تریس هیدروکلراید – SDS ( 50 میلی لیتر) ، ۶/۸ = pH
Tris- base Sigma 1/9 گرم (۵/۱ مولار)
SDS Merck 2/0 گرم (۴/۰ درصد)
تریس در ۳۰ میلی لیتر آب مقطر حل شده و پس از تنظیم pH (با اسید کلریدریک نرمال) به حجم
رسانده شده. پس از افزودن SDS در ºC4 نگهداری شد .
- تریس هیدروکلراید - SDS (100 میلی لیتر)، ۸/۶ = pH
Tris- base Sigma 0/6 گرم (۵/۰ مولار)
SDS Merck 4/0 گرم (۴/۰ درصد)
مطابق بند بالا تهیه می شود .
- آمونیوم پر سولفات (APS) 10%(10 میلی لیتر)
APS Sigma 1 گرم
در آب مقطر حل شده در ºC4 نگهداری شد .
- TEMED (tetramethylethylendiamine) Merck
- بافر الکتروفورز X 5(1 لیتر)
Tris - base Sigma 1/15 گرم
Glycine Sigma 72 گرم
SDS Merck 5 گرم
در آب مقطر حل و به حجم رسانده شد .
- بافر نمونه X 2(10 میلی لیتر)
محلول تریس هیدروکلراید ۸/۶ = pH 5/2 میلی لیتر
گلیسرول ۹۹% Sigma 2 میلی لیتر
SDS Merck 4/0 گرم
۲- مرکاپتو اتانول Sigma 2/0 میلی لیتر
بروموفنل بلو Merck 10 میلی گرم
مواد را به کمک آب مقطر مخلوط کرده و به حجم رسانده سپس در حجم های ۵۰۰ میلی لیتری در ºC20- نگهداری شد .
- بافر نمونه X 6(10 میلی لیتر)
محلول تریس هیدروکلراید ۸/۶ = pH 7 میلی لیتر
گلیسرول ۹۹% Sigma 3 میلی لیتر
SDS Merck 1 گرم
۲- مرکاپتو اتانول Sigma 5/0 میلی لیتر
بروموفنل بلو Merck 12 میلی گرم
مواد را به کمک آب مقطر مخلوط کرده و به حجم رساندیم سپس در حجم های ۵۰۰ میلی لیتری در ºC20- نگهداری شد .
تانک الکتروفورز به همراه شیشه های ژل BioRad
سر سمپلر کریستال ۱-۵۰ میلی لیتری
منبع تغذیه الکتریکی
سمپلر و سر سمپلر استریل
سانتریفوژ و اسپکتوفتومتر
روش کار :
به رسوب باکتریایی قبل از القاء ( BI) وبعد از القاء (AI) معادل با حجمشان بافر نمونه X 2 افزوده و بخوبی مخلوط کردیم . آنگاه نمونه ها را به مدت ۵ دقیقه در آب در حال جوش حرارت دادیم و تا زمان بردن روی ژل در ºC 20- نگهداری نمودیم .
شیشه های مخصوص تهیه ژل را با الکل ۷۰% تمیز کرده پس از خشک شدن روی هم سوار کرده و در هولدینگ قرار دادیم.
ژل Resolving در حجم متناسب با اندازه مورد نظر تهیه می شود . در اینجا برای ابعاد cm 4 × ۸ به این
ترتیب تهیه می شود: ۲ میلی لیتر میکس آکریل آمید ، ۳/۱ میلی لیتر تریس هیدروکلراید(۸/۸ = pH) ، ۶/۱ میلی لیتر آب مقطر ، ۵۰ میکرولیتر APS ، ۲ میکرولیتر TEMED . بلافاصله پس از مخلوط کردن به آرامی در فاصله دو شیشه ریخته ( تا ۴/۳ ارتفاع شیشه ها) شده و روی آن با الکل پر می شود . در طی بسته شدن ژل ressolving ژل Stacking را تهیه می نمائیم ، (در اینجا۳۳/۰ میلی لیتر محلول میکس
آکریل آمید ، ۲۵/۰ میلی لیتر تریس هیدروکلراید (۸/۶ = pH) ،۴/۱ میلی لیتر آب مقطر.APS وTEMED موقع ریختن ژل بایست به مخلوط اضافه گردد) . الکل موجود بر روی ژل تخلیه شده و مابقی قطرات با کاغذ صافی به آرامی خشک شده آنگاه ۲۰ میکرولیتر APS و ۲ میکرولیتر TEMED به مخلوطStacking اضافه شده و سپس ژل Stacking را ریخته و با پر شدن فضا شانه مناسب و تمیز شده با الکل، بصورت اریب داخل ژل وارد می شود. پس از بسته شدن ژل ، شیشه های حاوی ژل از هولدینگ جدا شده ، قالب شیشه ای را در تانک الکتروفورز منتقل می کنیم . شانه را به آرامی خارج کرده از نمونه مورد نظر و شاخص وزن مولکولی که (روی یخ نگهداری می شوند) به کمک سمپلر و سر سمپلر کریستال به مقدار کافی در چاهک های موجود ریخته(بیشترین ظرفیت چاهکهای ژلی که با سیستم بیورد تهیه می شود ۱۵ میکرولیتر می باشد) ، تانک الکتروفورز را با بافر تانکX1 پر کرده و جریان الکتریکی را برقرار می نمائیم .پس از گذشت زمان لازم قالب را جدا کرده ، ژل را از قالب خارج کرده بخش Stacking را جدا می کنیم.
مواد و وسایل مورد نیاز برای رنگ آمیزی کوماسی بلو
- رنگ کوماسی بلو Staining solution (100 میلی لیتر)
کوم
اسی بلو pharmacia 5/0 گرم
ایزوپروپانول Merck 25 میلی لیتر