رسوب باقی مانده در ml 5 آب دوبار تقطیر حل شد.
۳-۷: اندازه گیری PRP به روش بیال
۳-۷-۱: مواد و تجهیزات لازم
لوله ۱۵، حمام بن ماری، سمپلر، دستگاه اسپکتروفتومتر،
محلول PRP استاندارد، محلول اورسینول g/l 100، یخ خورد شده، محلول فریک کلراید g/l 5/0 ، آب مقطر، محلول ریبوز
۳-۷-۲: روش اندازه گیری PRP
غلظت PRP توسط واکنش بیال اصلاح شده (۱۵) و با بهره گرفتن از ریبوز(به عنوان قند پنج کربنه) و PRP خالص استاندارد انجام شد.
اساس این تست تبدیل قند پنج کربنه (برای مثال: ریبوز ) در حضور اسید گرم به فورفورال است که بعدا با اورسینول^[۵۹] واکنش داده و رنگ سبز ایجاد می کند.

µl 200 از PRP استخراج شده به همراه µl 1800 آب مقطر به یک لوله اضافه شد (نسبت ۱ به ۱۰).
µl200 از PRP استاندارد به همراه µl 1800 آب مقطر به لوله دیگر اضافه شد.
به هر کدام از لوله ها ml 2 فریک کلراید و µl 200 اورسینول اضافه شد.
لوله ها به مدت ۳۰ دقیقه در حمام بن ماری با دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد قرار داده شد.
سپس به مدت ۱ دقیقه در مخلوط آب و یخ قرار داده شد.
جذب نوری نمونه ها با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm 670 سنجیده شد.
محاسبه ضریب تبدیل بر اساس ساختار PRP که توسط Crisel و همکاران شرح داده شده است انجام شد(۲۳).
۳-۸:تعیین تعداد کپی cap با بهره گرفتن از Real-time PCR:
۳-۸-۱: مواد و تجهیزات لازم:
دستگاه Real-time PCR، ویال ۹۶ خانه Real-time PCR، کیت مسترمیکس SYBR green، آب DDW (DNAase free)،
۳-۸-۲: شرایط واکنش:
تست Real-time PCR برای مشخص کردن تعداد دقیق کپی از جایگاه cap در ژنوم باکتری انجام شد.
برای این منظور پرایمرها طبق جدول ۳-۴ برای اهداف زیر طراحی شد.
- منطقه IS1016 (پرایمر E): این منطقه به دلیل داشتن ارتباط مستقیم با خصوصیات منطقه capB در نظر گرفته شد.
- ژن rpoB که یک ژن تک کپی و خانه دار^[۶۰] است و کد کننده (پرایمر F) : این ژن یک ژن تک کپی خانه دار است که کد کننده زیر واحد بتای RNAپلیمراز بوده و به عنوان کنترل داخلی و بررسی صحت انجام واکنش در نظر گرفته شد.
- لوکوس اختصاصی Hib (پرایمر G): که نسبت آن به ژن تک کپی rpoB نشان دهنده تعداد کپی capB خواهد بود.
- پرایمر های استاندارد برای هر یک از موارد فوق (H, I, J)
جدول۳-۴: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR