های مناسب عناصرغذایی معرفی کردند که به محیط کشت موراشیک و اسکوگ (MS) لقب گرفت (باقری و همکاران، ۱۳۸۶). از محیط کشت­های معروف دیگر می­توان به محیط کشت وایت^[۱۰] (۱۹۴۳)، لینسمایر و اسکوگ^۲ (۱۹۶۵)، گامبورگ و همکاران^۳ (۱۹۶۸) و نیچ و نیچ^۴(۱۹۶۹) اشاره نمود که هر کدام ازآن­ها برای نوع خاصی از گیاه و هدف­های مشخصی از کشت استفاده می­شوند (واسیل و تروپ^۵، ۱۹۹۸ ).

۲-۳-۸-۲ مزایای تکثیر از طریق کشت بافت
۱- تکثیر از طریق کشت بافت در تمام طول سال انجام می­ شود و وابسته به زمان و فصل خاصی نیست.
۲- عاری بودن این روش از پاتوژن­ها به دلیل شرایط کاملاً استریل آزمایشگاه کشت بافت.
۳- همه فاکتورهای محیطی مورد نیاز در روش کشت بافت دقیق و کامل کنترل می شوند.
۴- از مواد گیاهی کمتری استفاده می­ شود.
۵- احتیاج به خزانه و مزرعه نمی ­باشد.
۶- در کشت بافت، امکان تولید انبوه گیاه وجود دارد.
۳-۳-۸-۲معایب تکثیر از طریق کشت بافت
۱- پرهزینه بودن این روش
۲- وسایل، ابزار و دستگاه­های مورد نیاز خیلی گران می­باشند.
۲- نیازمند افراد مجرب و متخصص می­باشد (دانشور،۱۳۹۲).
۴-۸-۲ تهیه محیط کشت
رشد، تمایز، نمو و تحولات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی بافت‌های گیاهی نیازمند تامین تعدادی از عناصر شیمیایی و برخی عوامل فیزیکی است. تمایز و رشد مورفولوژیکی بافت‌های گیاهی در شرایط درون شیشه ­ای، همانند شرایط محیط بیرون تحت تاثیر مواد غذایی یا به عبارت بهتر، اجزاء محیط کشت می‌باشد. در هر محیط کشت بافت، موادی مانند نمک‌های معدنی پرمصرف و کم­مصرف، اسیدهای آمینه ضروری، قند (ساکارز) به­عنوان منبع کربن، ویتامین‌ها برای تضمین رشد و تمایز و هورمون‌های متمایز­کننده وجود دارد (چاولا، ۱۳۸۲). به­ طور کلی مواد تشکیل دهنده محیط کشت شامل: موادغذایی (آب، عناصر پرمصرف، عناصر کم­مصرف، قند)، تنظیم­کننده­ رشد گیاهی، ویتامین‌ها، مواد تکمیل­کننده آلی نامشخص مانند شیره نارگیل، عصاره مخمر و عصاره مالت و مواد ژله­کننده مثل آگار می­باشد (هارتمن و کستر^[۱۱]، ۱۹۹۱). انتخاب محیط کشت برای موفقیت در کشت بافت ضروری است. هیچ محیط کشت مشخصی را نمی­ توان برای رشد انواع سلول‌ پیشنهاد کرد و به همین دلیل اغلب برای تهیه یک محیط کشت مناسب با هدف مورد نظر، تغییراتی در آن ایجاد می­ شود. مسیر تعیین یک محیط کشت به هدف کشت سلول و بافت بستگی دارد. انتخاب صحیح محیط کشت تاثیر مهمی در موفقیت فرایند کشت بافت و باززایی گیاهان دارد (شریفی و همکاران ،۱۳۸۹).
۱-۴-۸-۲ آب
در کشت بافت باید به کیفیت آب توجه زیادی شود. حجم زیادی از یک محیط کشت را آب تشکیل می­دهد به همین علت، آبی که برای تهیه محیط‌‌‌های کشت بکار برده می‌شود، باید تقطیر شود که این کار توسط دستگاه آب مقطرگیری انجام می­ شود. باید از ذخیره کردن دراز مدت آب مقطر در ظروف پلی اتیلنی خودداری شود، زیرا ممکن است اینگونه ظروف موادی آزاد کنند که نسبت به کشت خاصیت سمی داشته باشد. همچنین در ظروف شیشه ­ای پیرکس^[۱۲] هم نگهداری طولانی مدت پیشنهاد نمی‌شود، زیرا ممکن است مقدار قابل توجهی باکتری در شرایط غیراستریل ذخیره­سازی در داخل آب مقطر رشد نمایند (دادز و رابرتز^۳،۱۹۹۲).
۲-۴-۸-۲ نمک­های معدنی
مواد معدنی مهم­ترین گروه مواد غذایی در محیط کشت هستند. نمک­های معدنی عبارتند از عناصر پرمصرف (نیتروژن، فسفر، پتاسیم، کلسیم، منگنز و گوگرد) و عناصر کم­مصرف (روی، مس، منیزیم، آهن، کبالت، مولیبدن، کلر، ید، بُر) می­باشند. معمولاً از محلول­های غلیظ ذخیره^۴ برای ساختن محیط کشت استفاده می­ شود. محلول­های ذخیره باید در دمای ۴+ درجه سانتی گراد و در شیشه­های تیره نگهداری شوند (باجوانی و رازدان^۵، ۱۹۹۶).
۳-۴-۸-۲ کربن و منبع انرژی
از میان کربوهیدرات‌هایی که در محیط کشت بافت گیاهی به­کار می­رود، ساکارز ترجیح داده می‌شود. گلوکز و فروکتوز در برخی از موارد می‌تواند جایگزین شود. کربوهیدرات باید در محیط کشت به کار برود چون بافت­های سلولی جدا شده کمتر می‌توانند فتوسنتز کنند یا به علت تاریکی فتوسنتز انجام نمی‌شود. ساکارز موجود در کشت به سرعت به فروکتو و گلوکز شکسته می‌شود ابتدا گلوکز و پس از آن فروکتوز توسط سلول­ها به کار برده می‌شود (تورس، ۱۹۹۴).
۵-۴-۸-۲ ویتامین‌ها
ویتامین‌ها نقش کاتالیزور داشته و در گیاهان سنتز می‌شوند. در کشت بافت بسیاری از ویتامین‌ها توسط یاخته‌های در حال رشد و نمو سنتز می‌شوند، اما مقادیر ساخته شده کمتر از مقادیر مورد نیاز است. از این رو نیاز است، ویتامین‌های ضروری را به مقدار مورد نیاز به محیط اضافه نمود. ویتامین‌های _۱B، _۳B، _۵B، _۶B و میواینوزیتول^[۱۳] نسبت به بقیه، بیشتر مورد نیاز هستند. ویتامین‌های _۳B و _۶B هرچند که به محیط کشت اضافه می‌شوند، اما در تعدادی از گونه‌ها برای رشد یاخته و تولید کالوس ضروری نیستند (پیری و نظریان فیروزآبادی، ۱۳۸۵).
غلضت بالای اسید اسکوربیک که بعضی موارد اضافه می‌شود، به این معنا نیست که گیاه چنین نیاز بالایی دارد. ویتامین ث در غلضت بالا، به عنوان آنتی اکسیدان جهت جلوگیری از تولید ترکیبات فنولیک استفاده می­ شود. بسیاری از گیاهان قادرند که ویتامین‌ها را در حالت کشت درون شیشه ای، سنتز کنند (پیریک، ۱۹۷۶).
۶-۴-۸-۲ تنظیم کننده‌های رشد
در کشت بافت، برای تولید کالوس و تقسیم سلولی به اکسین و سیتوکینین به عنوان تنظیم­کننده رشد نیاز می­باشد. اکسین‌ها رشد طولی سلول‌های ساقه گیاهان را تحریک می‌کنند و سایتوکنین­ها نه تنها باعث تقسیم سلولی بافت‌های گیاهی می‌شوند بلکه موجب پهن شدن سلول نیز می­گردند (دانشور، ۱۳۹۲).
اکسین‌ها به طور عمده در کشت بافت به کار می‌روند. تنها اکسین طبیعی lAA است که با غلضت ۱۰-۰۱/۰ میلی­گرم در لیتر به محیط کشت اضافه می‌شود. در حالی که اکسین‌های مصنوعی از قبیل ایندول بوتیریک اسید^[۱۴] (IBA)، نفتالین­استیک­اسید^۲ (NAA)، ۲ و۴دی کلروفنوکسی استیک اسید^۳(D-2,4)، دیکامبا^۴و پیکلورام^۵ اثر فیزیولوژیکی بیشتری دارند و در غلظت­های ۰۰۱/۰ تا ۱۰ میلی­گرم در لیتر به کار می‌روند (هارتمن و کستر، ۱۹۹۱ و رینرت و بجاج^۶، ۱۹۹۷).
برای تقسیم سلولی، رشد طولی سلول، تغییر و تمایز سلول و تشکیل اندام در بافت‌های کشت­ شده، افزودن اکسین و سیتوکنین مناسب به محیط کشت کاملا ضروری است. سایتوکنین‌هایی که معمولا در محیط کشت به کار می‌رود عبارتند از: ۶-بنزیل آمینوپیورین^۷ (BAP) ،یا ۶-بنزیل آدنین^۸ (BA)، ایزوپنتیل آدنین^۹ (ip2)، ان-(۲-فورانیل متیل) ۱-اچ-پیورین-۶-آمین^۱۰ (کینتین)^۱۱ ، ۶-(۴-هیدروکسی-۳-متیل-ترانس-۲-بوتنیل­آمینو)­پیورین^۱۲ (زآتین)^۱۳می‌باشد (دادز و رابرتز، ۱۹۹۲).
نوع اندام­زایی که در کشت بافت گیاهی اتفاق می‌افتد عمدتاً به نسبت غلظت اکسین‌ها و سایتوکنین‌های موجود در محیط کشت بستگی دارد. تولید ­ریشه ^۱۴در گیاهچه‌، رویان­زائی^۱۵ و القای­کالوس^۱۶همگی در صورت زیاد بودن نسبت اکسین به سایتوکنین می‌باشد در حالی که پراوری شاخساره^۱۷ از جوانه­های جانبی و انتهایی هنگامی انجام می‌شود که نسبت سیتوکنین به اکسین بیشتر باشد. اسید جیبرلیک^۱۸ (_۳GA) تنظیم کننده رشد دیگری است که در برخی موارد در محیط‌های کشت به کار می‌رود (دکلرک^۱۹، ۲۰۰۶).
۷-۴-۸-۲ آگار
محیط کشت که توسط نمک‌های پرمصرف، کم­مصرف، ویتامین‌ها، قند و تنظیم کننده‌های رشد ساخته می‌شود، به­ صورت مایع است. محیط کشت مایع برای هوادهی باید روی شیکر باشد که این کار مشکل است و تسهیلات زیاد نیاز دارد، به همین دلیل محیط کشت جامد پیشنهاد شد. برای تولید محیط کشت جامد از آگار استفاده می­ شود. آگار پلی­ساکاریدی است که از مشتقات یک نوع علف هرز دریایی (بعضی از جلبکها) محسوب می‌شود. این ماده از گرانترین مواد شیمیایی موجود در کشت بافت است. غلضت عادی آگار بین ۶/۰ تا ۸/۰ درصد است. اگر غلضت کمتر از ۴/۰% در محیط کشت به کار رود، به­ ویژه زمانی که pH هم پایین است، به خوبی ژله­ای نمی‌شود. در کشت درون شیشه ­ای چنان­چه غلضت آگار خیلی زیاد باشد، محیط کشت سفت می­گردد و جذب عناصرغذایی برای ریزنمونه مشکل می­ شود (پیریک، ۱۹۷۶ و دانشور، ۱۳۹۲).
۵-۸-۲ گندزدایی
مهم­ترین مسئله­ای که در کشت بافت بایستی رعایت شود این نکته است که هر نوع عمل مرتبط با کشت بایستی کاملاً در شرایط گند­زدایی شده صورت گیرد وگرنه به­ دلیل انواع آلودگی هیچ نتیجه­ای به­دست نخواهد آمد. باکتری‌ها و قارچ‌ها از جمله مهمترین میکروارگانیسم‌هایی هستند که موجب آلودگی در کشت بافت می­گردند. این میکروارگانیسم‌ها در محیط کشت بافت که شامل عناصر غذایی، ویتامین­ها و ساکارز هستند، بسیار سریعتر از نمونه کشت شده رشد می‌یابند. بنابرین بافت‌های گیاهی در حال رشد و تمایز، به محض آلوده شدن، دچار فساد و نابودی می‌شوند. این میکروارگانیسم‌ها حتی در هوای بازدم برخی از ما انسان‌ها وجود دارند. بنابرین، تمامی ابزار، وسایل، محیط آزمایشگاه، دست‌های شخص محقق و حتی محیط کشت بایسی کاملا ضدعفونی شده و استریل شوند (پیریک، ۱۹۷۶). به طور معمول میزان آلودگی در ریزنمونه­هایی که از گیاهان مزرعه­ای به­دست می ­آید، بیشتر از آن­هایی است که از مواد گیاهی رشد یافته در گلخانه یا اتاق رشد تهیه می­ شود. محلول‌ها و مواد گوناگونی برای استریل نمودن سطح گیاهی و نمونه‌ها پیشنهاد شده ­است. مهم­ترین این مواد هیپوکلریت سدیم (NaOCl) است، هرچند که هیپوکلریت کلسیم Ca(OCl)₂ نیز بسیار موثر است. بذرهای بالغ و رسیده، توسط مواد ضدعفونی­کننده، ضدعفونی سطحی می‌شوند (اثنی عشری و زکایی خسروشاهی، ۱۳۸۸).
درپژوهشی که توسط گائوراج و اوداگیری^[۱۵] (۲۰۱۱) انجام شد، دمبرگ‌های سالم از گیاه مادری Viola patrinii جدا شدند. ابتدا ۱۰-۵ دقیقه با مایع ضدعفونی کننده پریل ۵% پیش تیمارگشتند سپس ۲ الی ۳ بار با آب جاری شسته شدند. ریزنمونه‌ها شسته شده ۳-۲ دقیقه در الکل اتیلیک ۸۰% فروبرده شدند و پس از آن دو الی سه بار با آب مقطر استریل شستشو شدند. در ادامه در کلرید جیوه ((HgCl₂ ۱/۰% به­مدت ۳-۲ دقیقه غوطه ورشدند و دوباره با آب مقطر استریل مورد شستشو قرار گرفتند. نعیم و همکاران^[۱۶] (۲۰۱۳) برگ‌ و ساقه و دمبرگ‌های Viola odorata L. را از گیاهان ۴۵ روزه گلخانه­ای جمع­آوری کردند. ریزنمونه‌های گیاهی با آب جاری شسته شدند تا ذرات گرد و خاک ازآن پاک شود، سپس درالکل اتیلیک۷۰% برای یک دقیقه و در کلراکس ۵%، ۱۰-۸ دقیقه فروبرده شدند. در ادامه برای از بین رفتن اثر کلراکس، سه بار با آب مقطر اتوکلاو شده، شستشو داده شدند. نمونه‌ها برای خشک شدن روی کاغذ فیلتر استریل در پتردیش قرار گرفتند. زاهور و همکاران (۲۰۱۲) جوانه‌های جانبی و انتهایی Viola odorata را به­عنوان ریزنمونه استفاده کردند. ریزنمونه­ها ابتدا با آب جاری به­همراه مواد شوینده ضدعفونی شدند. سپس با آب مقطر دوبار تقطیر شده، شسته شدند. در ادامه روند گندزدایی ریزنمونه‌ها در محلول کلرید جیوه ۱/۰% برای ۵-۴ دقیقه فرو برده شده و سپس با آب مقطر دوبار تقطیرشده در زیر دستگاه لامینار ایرفلو بنچ^[۱۷] در شرایط کاملا استریل شستشو داده شدند. آتسوشی و همکاران^۴(۲۰۰۲) برگ‌های نابالغ Viola odorata را ابتدا با الکل اتیلیک ۷۰٪ برای یک دقیقه گندزدایی کرده، سپس در محلول هیپوکلریت سدیم ۱٪، به مدت ۱۵ دقیقه قرار دادند و در ادامه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. نوارهای باریک برگ‌ها توسط یک تیغ استریل بریده و روی محیط کشت قرار گرفتند. در پژوهشی دیگر که توسط بیدول و همکاران^۵ (۲۰۰۱) انجام شد، برگ‌ها و ساقه‌های گیاه Hybanthus floribundus، را از شاخه‌های جوان گرفته و برای استریل سطحی ابتدا در هیپوکلریت سدیم ۲/۱% به همراه چند قطره تویین^۶ ۲۰ به مدت ۵/۲ ساعت قرار گرفتند. در ادامه روند گندزدایی، بافت‌ها در سه مرتبه با آب مقطر استریل شده در زیر دستگاه لامینار ایرفلو شستشو داده شدند. بافت‌های آسیب دیده و مرده حذف و بافت‌های سالم روی محیط کشت قرار گرفتند. پراکش و همکاران^[۱۸] (۱۹۹۹) در پژوهشی بذرهای گیاه Hybanthus enneaspermus را با مایع ضدعفونی کننده تیپول^۲ ۱% به­مدت ۱۵ دقیقه شسته ، سپس به­مدت ۱ دقیقه در الکل اتیلیک ۷۰% فروبرده شدند. در ادامه روند گندزدایی از هیپوکلریت سدیم ۲% و تویین۲۰ برای ۲۰ دقیقه استفاده شد. پس از این مراحل، با آب مقطر استریل شستشو داده شدند.
۶-۸-۲ تشکیل کالوس
پینه (کالوس) توده سلولی پارانشیمی بی­شکل با دیواره سلولی نازک که منشأ آن سلول‌های تقسیم شونده بافت گیاهی مادری می‌باشد. بیشترکالوس در محل بریدگی و براثر ایجاد زخم در ریشه، ساقه و سایر اندام­های گیاهان تشکیل می‌شود (دادز و رابرتز،۱۹۹۲). نعیم و همکاران (۲۰۱۳) در پژوهشی از برگ، ساقه و دمبرگ گیاه، Viola odorata L. برای انگیزش کالوس استفاده کردند. نتایج آن‌ها نشان داد بهترین و موثرترین القاء کالوس روی محیط کشت حاوی BA (5/0میلی­گرم در لیتر) و D-4,2 (5/2 میلی­گرم در لیتر)، طی ۴۰ روز به میزان ۸۵% ریزنمونه­ها انجام گرفت. در آزمایشی دیگر ویجوشا و همکاران^۳ (۱۹۹۹) از کشت تخمک لقاح نیافته Viola odorata L.، کالوس بدست آورند. کالوس‌ها سبزتیره و متراکم و در اندازه بزرگ مشاهده شدند. بابر و کاب هوشان^۴ (۱۹۹۱) گزارش دادند که از ریشه، هیپوکوتیل^۵ و قسمت‌های کوتیلودون^۶ گیاه بنفشه سه رنگ (Viola tricolure) کالوس بدست آوردند. گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) گزارش دادند در محیط کشت MS با کمترین میزان NAA (44/13میکرومول) و BA (33/12میکرومول) بیشترین تولید کالوس را از دمبرگ Viola patrinii بدست آوردند. همچنین آن‌ها نشان دادند که با غلظت‌های ۷۵/۱۰ میکرومول NAA و ۸۸/۸ میکرومول BA میزان کالوس تولیدی متوسط بود. غلظت‌های بالای BA (33/13 میکرومول) و NAA (12/16 میکرومول) پاسخی به تولید کالوس ندادند. همچنین گزارش دادند با افزایش غلظت‌های کاینتین و NAA به ترتیب ۲۷/۱۶ و ۱۲/۱۶ میکرومول، کمترین کالوس تشکیل گردید و سپس از این کالوس‌ها رشدی صورت نگرفت. جیان و من^[۱۹] (۲۰۰۶) از هر دو ریز نمونه دمبرگ و برگ گیاه Viola wittrockiana در محیط کشت بدون اکسین ولی BA با غلظت­های ۲/۲، ۹/۸ و ۷/۱۷ میکرومول برلیتر کمترین میزان کالوس را گرفتند در حالی که محیط کشت توفوردی یا NAA (7/ 2 و ۸/۱۰ میکرومول NAA و ۴۵/۰میکرومول ۲,۴-D) به همراه ۹/۸ میکرومول بر لیتر BA تقریبا به ۱۰۰% کالوس دست یافتند. آتسوشی و همکاران (۲۰۰۲) بهترین نتیجه کالوس را از برگ Viola odorata L. با بهره گرفتن از غلظت‌های ۲-۱ پی ام ام^[۲۰] دیکامبا^۳ و ۱ پی پی ام تیدازرون به­دست آوردند. آن­ها در محیط کشت قرارگرفته در شرایط روشنایی با غلضت‌های برابر (۱، ۲ و ۵ پی پی ام ) از ۲ تنظیم کننده رشد، بیشترین القای کالوس را مشاهده کردند در صورتی که در شرایط عدم روشنایی بالاترین میزان عملکرد کالوس را از غلظت‌های ۲ پی­پی­ام دیکامبا و ۱ تا ۵ پی­پی­ام تیدازرون حاصل شد. همچنین بیشترین عملکرد کالوس را درمحیط کشت مایع در غلظت ۱درصد دیکامبا بدست آوردند. بهرا و مالیک^۴ (۲۰۱۱) از برگ و میان­گره‌های گیاه Hybanthus enneaspermus روی محیط کشت موراشیک و اسکوگ با غلضت‌های ۱ و ۲ میلی­گرم در لیتر توفوردی و کاینتین بهترین کالوس را بدست آوردند. پراکش و همکاران (۱۹۹۸) روی محیط کشت MS همراه با NAA به­تنهایی یا در ترکیب با BA از بذرهای Hybanthus enneaspermusکالوس تولید کردند. در حالی که روی محیط کشت بدون تنظیم کننده رشد یا روی محیط کشت همراه با BA به تنهایی، تولید کالوس موفقیت آمیز نبود. کالوس‌های تولید شده دارای رنگ زرد روشن و بافت شکننده و ترد بودند. بیدول و همکاران (۲۰۰۱) در پژوهشی از برگ و ساقه گیاه Hybanthus floribundus روی محیط کشت نیم قدرت MS همراه با تنظیم کننده‌های رشد BA وNAA کالوس تولید کردند.
۷-۸-۲ باززایی از کالوس
باززائی گیاه از کالوس از نظر ژنتیکی، کاملاً مشابه گیاه مادری می­باشد­. انگیزش اندام‌هایی نظیر ساقه و ریشه با اختصاصی شدن گروهی از سلول‌های پارانشیمی و تولید سلول­های مریستمی در بافت کالوس، آغاز می­ شود (اثنی عشری و زکائی خسروشاهی، ۱۳۸۸). شروع اندام زایی در کالوس پیرو قوانین شناخته شده­ای نبوده و تا حد زیادی غیرقابل پیش ­بینی می‌باشد. عوامل تعیین کننده اندام زایی تا­حدودی نامشخص بوده ولی عواملی از قبیل ساختار محیط کشت مانند ترکیبات آن شامل غلظت­های عناصر پرمصرف و کم مصرف، انتخاب نوع تنظیم­کننده­ های رشد، غلظت و نسبت آن­ها، انتخاب نوع ویتامین­ها و غلظت آن­ها، اسید­های آمینه، حتی نوع آب مقطر استفاده شده به­عنوان مثال یک بار یا دوبار تقطیر شده بر باززائی تاثیر گذار می­باشد. شایان ذکر است که عواملی مانند نوع ریزنمونه، سن آن، موقعیت آن روی گیاه و حتی گونه گیاه مادری از عوامل مهم محسوب می­شوند. برخی از پژوهشگران معتقدند که حتی زمان تهیه ریزنمونه نیز می ­تواند روی باززایی اثر داشته باشد. جنس شیشه­های کشت و همچنین حجم آن­ها و میزان محیط کشت درون شیشه از فاکتور­های مهم باززایی محسوب می­شوند. نوع آگار و غلظت آن را نباید از لیست مواد تشکیل دهنده محیط کشت، مخفی بماند. با این وجود رعایت نکردن این نکات می ­تواند در باززایی تاثیر بگذارد و موجب تنوع ژنتیکی^[۲۱] شود (دانشور، ۱۳۹۲).
بابر و کاب هوشان (۱۹۹۱) گزارش دادند باززایی شاخساره از کالوس تولید شده از ریشه، هیپوکوتیل و قسمت‌های کوتیلودون گیاه بنفشه سه رنگ (Viola tricolure) موفقیت آمیز نبوده است. ساتو^۲ و همکاران (۱۹۹۵) از کالوس‌های گرفته شده از دمبرگ بنفشه وحشی ( Viola patrinii) به باززایی شاخساره دست یافتند. نعیم و همکاران (۲۰۱۳) بهترین بازایی شاخساره در گیاه Viola odorata را (به طول ۵-۴ سانتی­متر و با ۳-۲ شاخه) روی محیط کشت نفتالین استیک اسید، جیبرلین اسید، نیترات نقره و تیدازرون (۵/۰ میلی­گرم در لیتر NAA، ۵/۱میلی­گرم در لیتر GA₃، ۴۲/۰میلی­گرم در لیتر AgNO₃، ۵/۲میلی­گرم در لیتر TDZ ) گزارش دادند. گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱)، در محیط کشت تمام قدرت MSبا غلظت‌های ۶۸/۲ میکرومول NAA و ۲۵/۲۳ میکرومول کاینتین بعد از ۴ هفته ۸۸ % باززایی شاخساره را از کالوس حاصل از دمبرگ گیاه Viola patrinii به­دست آوردند. همچنین مشاهده کردند ترکیب ۳۳/۱۲ میکرومولBA با ۶۸/۲ میکرومول NAA منجر به ۶۷% تشکیل شاخساره شد. جیان و من (۲۰۰۶) بیشترین درصد باززایی شاخساره (۹/۲۱درصد) از کالوس ریزنمونه دمبرگ را در محیط کشت موراشیک و اسکوگ با غلظت‌های ۸۹/۲ میکرومول برلیتر جیبرلین و ۶/۲۳ میکرومول در لیترAgNO₃، ۰۲/۰ (w/v) زغال فعال و ۵/۴ میکرومول در لیتر تیدازرون به­دست آوردند.
تاداهیکو^[۲۲]و همکاران (۱۹۹۵) از زیرکشت کردن ۵ ساله کالوس‌های فشرده، گرفته شده ار دمبرگ گیاه بنفشه وحشی، باززایی شاخساره انجام دادند. باززایی خوبی در محیط کشت نیم قدرت موراشیک و اسکوگ در غلظت‌های ^۱۲-۱۰ × ۵ میکرومول نفتالین استیک اسید و ^۱۲-۱۰ میکرومول کاینتین بدست آمد. خالید و همکاران^۲ (۲۰۱۰) در محیط کشت موراشیک و اسکوگ با غلظت‌های ۵/۱ میلی­گرم بر لیتر بنزیل آمینو پورین، ۱میلی­گرم بر لیتر IAA و۱/۰ میلی­گرم برلیتر کاینتین به­همراه ۳۰ گرم درلیتر ساکارز، باززایی شاخساره خوبی را از کالوس حاصل از دمبرگ گیاه Viola odorata مشاهده کردند. زاهور و همکاران^۳ (۲۰۱۲) گزارش دادند که ازدیاد شاخساره‌ها با افزایش میزان غلظت BAP و کاینتین در گیاه Viola odorata افزایش یافت و بهترین نتیجه از محیط کشت MS با غلظت‌های ۱۵ میکرومول NAA و ۱۰میکرومول BAP حاصل شد.
۸-۸-۲ ریشه­زایی
به­ طور­کلی، تشکیل ریشه در محیط کشت با غلضت نسبتاً بالای اکسین صورت می‌گیرد. (پیریک،۱۹۷۶). گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱) روی محیط کشت MS و محیط کشت نیم قدرت موراشیک و اسکوگ به­همراه غلضت‌های مختلف IAA، IBA و ساکارز ، شاخساره‌ها را ریشه دار کردند. رشد و تعداد ریشه‌های بدست آمده روی محیط کشت MS پایه (۶۳%) نسبت به محیط کشت نیم قدرت MS (36%) بیشتر بود. اما تفاوت معنی داری بین القای ریشه‌های بدست آمده از محیط کشت نیم قدرت MS با ۸۵/۹ میکرومول IBA و ۲% (w/v) ساکارز طی ۲۰ الی ۲۵ روز، را مشاهده کردند. جیان و من (۲۰۰۶) شاخساره‌های بدست آمده گیاهViola wittrokiana را به محیط کشت MS با ۱/۱ میکرومول NAA و ۱/۱ میکرومول BA برای طویل شدن و تشکیل ریشه انتقال دادند. اولین ریشه‌ها را طی ۴ هفته مشاهده کردند و ریشه‌های دوم در هفته بعد ظاهر گردیدند. خالید و همکاران (۲۰۱۰) در محیط کشت موارشیک و اسکوگ با غلظت‌های ۵/۱ میلی­گرم بر لیتر NAA، ۴ میلی­گرم برلیتر IBA و ۳ میلی­گرم در لیتر IAA به همراه ۶۰ گرم در لیتر ساکارز، توانستند شاخساره‌های گیاه Viola odorata را ریشه­دار کنند. بیدول و همکاران (۲۰۰۱) بهترین ریشه­زایی شاخساره را روی محیط کشت حاوی اکسین (۱۰۰ میکرومول بر لیتر IBA) که پس از ۲۴ ساعت به محیط کشت بدون تنظیم کننده رشد انتقال داده شده بودند، مشاهده کردند.
۹-۸-۲ سازگاری و انتقال
گائوراج و اوداگیری (۲۰۱۱)، گیاهچه‌های ریشه­دار شده را به گلدان‌های حاوی، خاک استریل، ماسه و کود خشک گاوی به نسبت ۱:۱:۱ انتقال دادند و برای سازگاری در گلخانه نگه داری کردند. ۴ هفته پس از انتقال، ۸۵% گیاهچه‌ها زنده ماندند. جیان و من (۲۰۰۶) گیاهچه‌های ریشه­دار شده Viola wittrockiana را به خاک گلخانه انتقال دادند و ۹۰% گیاهچه‌های ریشه­دار شده بعد از انتقال به خاک زنده ماندند. پراکش و همکاران (۱۹۹۸) زمانی که طول ریشه گیاهچه‌های Hybanthus enneaspermusبه ۴ الی ۵ سانتی متر رسید بعد از شستشوی دقیق ریشه‌ها با آب جاری، گیاهچه‌های را به گلدان‌هایی با عمق ۱۰ سانتی متر با نسبت ۱:۱ خاک و ورمیکولیت که اتوکلاو شده بودند انتقال دادند. گیاهچه‌ها دو هفته زیر کیسه‌های پلی اتیلینی نگه داری شدند و بعد از آن به گلدان‌های ۲۰ سانتی متری محتوی خاک باغچه منتقل شدند، مدتی بعد در مزرعه کشت گردیدند.
فصل سوم
مواد و روش ها
فصل سوم
مواد و روش ها
۱-۳ تاریخ انجام تحقیق
این پژوهش در سال ۹۳-۱۳۹۲ در آزمایشگاه کشت بافت گروه علوم باغبانی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین اهواز انجام شد.
۲-۳ آماده سازی وسایل
تمام وسایل مورد نیاز در تمامی آزمایش‌ها در ابتدا با آب معمولی و مایع ظرف شویی شسته و سپس با آب مقطر آب­کشی شدند. کلیه وسایل مانند پنس، پتری­دیش‌، اسکالپل، پیش از اتوکلاو در آلومینیوم فویل قرار داده شدند، محیط‌های کشت، ظروف و شیشه آب کشت محتوی آب مقطر، در دمای ۵/۱۲۱ درجه سانتی گراد، فشار ۱ اتمسفر (۱۵ پی اس آی^[۲۳]) به مدت ۲۰-۱۵دقیقه با دستگاه اتوکلاو (ساخت شرکت ابزار طب ماهان) گندزدایی شدند. پس از هر آزمایش، لامپ UV اتاق کشت به­مدت نیم ساعت برای گندزدایی محل آزمایش روشن می‌شود. هم­چنین لامپ UV دستگاه لامینار ایر فلو نیز پیش از هر آزمایش حدود ۳۰ دقیقه روشن گردید. پس از گذشت چند دقیقه ازخاموش شدن لامپ­های UV، دستگاه لامینار ایر فلو با الکل اتیلیک ۷۰% ضدعفونی و سپس با دستمال کاغذی خشک شد. برای انجام آزمایش، وسایل مورد نیاز و شیشه‌های کشت به زیر دستگاه انتقال داده شد. تمام مراحل ضدعفونی ریز نمونه‌ها و کشت آن‌ها در زیر لامینار ایر فلو به­ صورت کاملاً استریل انجام گردید.
۳-۳ تهیه مواد گیاهی
بذرهای استریل _۱F گیاه گل بنفشه رقم Viola odorata L. مورد استفاده در این تحقیق از شرکت پاکان بذر اصفهان خریداری شد. بذرها تا زمان استفاده در سردخانه واقع در آزمایشگاه کشت بافت در دمای ۱±۴+ درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
۴-۳ تهیه محیط کشت
۱-۴-۳ تهیه محلول‌های پایه
در تمامی آزمایش‌های انجام شده از محیط کشت پایه موراشیک واسکوگ (MS) تغییر یافته^[۲۴] استفاده شد. از آنجایی که بعضی از ویتامین‌ها و تنظیم­کننده‌های رشد بر اساس احتیاج ریزنمونه اضافه می­گردد، بنابراین این محیط کشت، محیط کشت موراشیک واسکوگ تغییریافته نام می‌گیرد. با توجه به این­که عناصرپرمصرف^۲ و کم­مصرف^۳ موردنیاز یک لیتر محیط کشت بسیار اندک می­باشند، بنابرین برای افزایش دقت در توزین این مواد و همچنین جلوگیری از اتلاف وقت، معمولاً برای هر عنصر استوک^۴‌ با غلظت‌های چند برابر ساخته تا از آن‌ها در موقع تهیه محیط کشت استفاده شود. محلول پایه عناصر پرمصرف ۱۰ برابر غلظت و محلول پایه عناصر کم­مصرف ۱۰۰ برابر غلظت تهیه می‌شوند. برای تهیه محلول پایه هر عنصر ابتدا مقدار هر نمک پرمصرف و کم­مصرف را جداگانه با توجه به جدول ۱-۳ به ترتیب به میزان ۱۰و ۱۰۰ برابر غلظت وزن کرده و در داخل بشر همراه با ۶۰۰ میلی­لیتر آب مقطر بر روی هات پلیت با یک مگنت حل کرده و پس از حل شدن با آب مقطر استریل به حجم یک لیتر رسانده شد. سپس این محلول‌ها در شیشه‌های تیره رنگی ریخته و در یخچال در دمای ۴+ نگهداری شدند.
۵-۳ نحوه آماده کردن محلول محیط کشت