اندوتلین ۱:
سطح اندوتلین ۱ سرم خون در هر دو گروه توسط کیت الایزا[۲۵۹] و طبق روش کار مندرج در آن اندازه ­گیری شد.
اندازه‌گیری نیتریک اکساید و اندوتلین ۱ در سرخرگ ششی:
سرخرگ ششی بعد از خارج شدن از بدن و تا زمان اندازه‌گیری نیتریک اکساید و اندوتلین ۱ در فریزر ۸۰- نگه‌داری شد. ابتدا نمونه‌های سرخرگ ششی وزن شد و بافت‌ها به روش چاپمن و وایدمن، ۲۰۰۶a با اندکی تغییر هموژن شدند. به طور خلاصه بدین صورت که بعد از وزن کردن بافت سرخرگ به ازاء هر گرم بافت سرخرگ ششی ۱۰ میلی‌گرم بافر هموژنیزاسیون که شامل ۲۵ میلی مولار تریس اسیدکلریدریک با pH 4/7، ا میلی مولار ادی تی آ، ا میلی مولار اتیلن گلایکول بیس (بتا آمینواتیل اتر) ۴ ان تارتاریک اسید[۲۶۰] اضافه گردید و با دستگاه هموژنایزر هموژن گردید. هموژن به دست آمده به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد با سانتریفیوژ g10000 سانتریفیوژ شد و وسوپرناتانت شفاف برداشته شده در داخل تیوب‌های میکروسانتریفوژ روی یخ نگهداری شد و با بهره گرفتن از کیت‌های نیتریک اکساید و اندوتلین ۱ غلظت نیتریک اکساید و اندوتلین ۱ به ازاء هر گرم از بافت سرخرگ ششی بدست آمد.
اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدهاید[۲۶۱] خون:
از روش پانس[۲۶۲] و همکاران، ۱۹۸۵ برای اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدهاید استفاده شد که شامل مراحل زیر است. مقدار ۵/۰ سی‌سی پلاسما با ۱ سی‌سی اسید تری‌کلرواستیک مخلوط شده و سپس با سانتریفیوژ ۴۲۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شده و مایع رویی آن جدا شد. سپس ۵/۰ سی‌سی از محلول رویی با ۵/۰ سی‌سی محلول اسید تیوباربیتوریک ۶۷/۰ درصد مخلوط شده و به مدت ۱۰ دقیقه در بن ماری جوش C º ۱۰۰ قرار گرفت و سپس سرد شد و میزان جذب آن در طول موج nm 532 توسط دستگاه اسپکتوفتومتری خوانده شد و با بهره گرفتن از منحنی استاندارد غلظت مالون‌دی‌آلدهاید موجود در نمونه­ها بدست آمد.
پایان نامه
اندازه‌گیری قدرت آنتی‌اکسیدانی[۲۶۳] و گلوتاتیون پراکسیداز خون:
از روش FRAP[264] برای اندازه‌گیری قدرت آنتی‌اکسیدانی پلاسما ( بنزی و استرین[۲۶۵]، ۱۹۹۶) و فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز ( ماتز[۲۶۶] و همکاران، ۲۰۰۰) استفاده شد. روش سنجش FRAP بر اساس انتقال الکترون از آنتی‌اکسیدان‌ها به آهن سه ظرفیتی و تبدیل آن به آهن دو ظرفیتی و تغییر در جذب به وجود آمده در اثر این تغییر استوار است. در این روش ۲۵۰ میکرو لیتر از پلاسما با ۷۵۰ میکرو لیتر از محلول FRAP [۲۶۷] به مدت ۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند و جذب در طول موج ۵۹۳ نانومتر اندازه‌گیری شد (کوکامیس و همکاران، ۲۰۰۰).
فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز با اندازه‌گیری اکسیداسیون NADPH به NAD+ و کاهش جذب ایجاد شده در اثر این تغییر در طول موج ۳۴۰ نانومتر اندازه‌گیری شد. دویست میکرو لیتر از پلاسما با بافر فسفات ۲۰/۰ مولار با ۲/۷ pH=، ۱۵ میلی مولار گلوتاتیون و ۵۰ واحد گلوتاتیون ردوکتاز به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس ۵۰/۱ میلی مولار NADPH و ۲ میلی مولار H2O2 اضافه گردید و کاهش جذب در طول موج ۳۴۰ نانومتر در ۹۰ ثانیه با دستگاه اسپکتوفتومتری اندازه‌گیری شد.
اندازه‌گیری فعالیت سوپراکسید دیسموتاز[۲۶۸] خون:
برای اندازه‌گیری فعالیت سوپراکسید دیسموتاز از کیت سوپراکسید دیسموتاز[۲۶۹] استفاده شد. اساس روش آن بدین صورت است که گزانتین و گزانتین اکسیداز تولید آنیون سوپراکسید می‌کنند که اکسید هیدروکسیل آمین به شکل نیتریت تولید رنگ بنفش می‌کند که جذب آن در طول موج ۵۵۰ نانومتر اندازه‌گیری شد و فعالیت سوپراکسید دیسموتاز با بهره گرفتن از منحنی استاندارد محاسبه شد ( بالوچامی[۲۷۰] و همکاران، ۲۰۱۰).
اندازه‌گیری گلوتاتیون پراکسیداز در بافت کبد:
برای اندازه‌گیری آنزیم‌های موجود در کبد، ابتدا باید یک محلول هموژن از بافت کبد تهیه کنیم. برای تهیه محلول هموژن بافت کبد از روش اقبال[۲۷۱] و همکاران، (۲۰۰۲) استفاده شد. به طور خلاصه در این روش ۲۰۰ میلی‌گرم بافت کبد را در داخل محلول بسیار سرد شده ۱ درصد تریتون ایکس ۱۰۰[۲۷۲] و محلول نمکی فسفات بافر ۰۱/۰ مولار با ۲/۷ pH, قرار داده شد و سپس طبق روش آسیکاینن[۲۷۳] و همکاران، ۱۹۹۸ با بهره گرفتن از دو لایه توری متوازن (متوسط) فیلتراسیون صورت گرفت. میزان پروتئین بافت هموژن شده با بهره گرفتن از کیت اندازه‌گیری شد. برای اندازه‌گیری گلوتاتیون پراکسیداز از روش اسپکتوفتومتری در طول موج ۳۴۰ نانومتر استفاده شد و میزان فعالیت آن به صورت میلی‌گرم پروتئین بیان شد .
اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدهاید در بافت کبد:
برای اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدهاید در از روش چریان و همکاران، (۱۹۹۶) استفاده شد که به طور خلاصه شامل مراحل ذیل است. ۲ گرم از بافت کبد خرد شده در لوله ۵۰ میلی لیتری قرار گرفت و ۱۸ میلی لیتر اسیدپرکلریک ۸۶/۳ درصد به آن اضافه شد. ۵۰ میکرو لیتر محلول BHA[274] به آن اضافه شد. سپس به مدت ۳۰ ثانیه با بهره گرفتن از دستگاه هموژنایزر، هموژن گشت. در دو نسخه، محلول هموژن شده توسط واتمن ۱ به لوله شیشه‌ای ۲۵ میلی لیتری فیلتر شد. ۲ میلی لیتر از محلول فیلتر شده به همراه ۲ میلی لیتر از محلول ۲۰ میلی مولار ۲- تیوباربیتوریک اسید در داخل بن ماری جوش به مدت ۳۰ دقیقه انکوبه شد. برای تهیه بلانک همه این مراحل انجام گرفت، فقط در نمونه کبد در داخل لوله قرار نداشت. برای تهیه استاندار هم از محلول تیوباربیتوریک اسید با غلظت مشخص استفاده شد. جذب نوری در طول موج ۵۳۱ نانومتر اندازه‌گیری شد و میزان تیوباربیتوریک اسید به صورت میلی‌گرم مالون‌دی‌آلدهاید به ازاء هر کیلوگرم بافت بیان شد.
بررسی تغییرات مورفولوژی در بطن راست نمونه‌های زنده و تلفات، سرخرگ ششی و شش‌های نمونه‌های زنده:
پس از کشتار جوجه‌ها و خارج نمودن قلب (بطن راست)، سرخرگ ششی و شش‌ها جهت بررسی‌های مورفولوژی از این قسمت‌ها نمونه‌برداری شد. ابتدا با محلول بافر (شامل ۷ میلی مول منو فسفات سدیم، ۳ میلی مول دی فسفات سدیم، ۱۳۰ میلی‌مول کلرید سدیم و ۴/۷ (pH, شستشو داده شد تا خون و مواد خارجی از آن جدا شود و برای اینکه بافت‌های مورد نظر حالت طبیعی خود را از دست ندهد فوراً در فیکساتور[۲۷۵] قرار داده شدند.
تهیه فیکساتیو فرمالدئید بافر شده:
برای تهیه این محلول ۱۰۰ سی سی فرمالدئید ۳۷ درصد و ۹۰۰ سی سی آب مقطر به همراه ۴ گرم فسفات منو سدیم[۲۷۶] و ۵/۶ گرم فسفات دی سدیم[۲۷۷] مخلوط شد و pH این محلول حدود ۴/۷ – ۲/۷ تنظیم شد.
برای اینکه روند فیکساسیون به خوبی انجام گیرد، ابعاد نمونه‌ها تا حد امکان کوچک انتخاب گردید و حجم فیکساتیو حدود ۱۰۰ – ۵۰ برابر حجم نمونه بود و نمونه‌ها به مدت ۲۴ ساعت درون فیکساتیو باقی ماندند. سپس نمونه‌های فیکس شده با فرمالدئید ۱۲ ساعت در آب جاری شستشو داده شدند، لازم به یادآوری است که شستشو برای نمونه‌های فیکس شده در بوئن لازم نیست و در آخر نیز مراحل پاساژ یا گردش بافت بر اساس روش‌های متداول انجام شد. ادامه آماده سازی بافت در مورد نمونه‌های فیکس شده با فرمالدئید شامل مراحل زیر است:
آبگیری:
درصد الکل مدت حجم.
الکل اتیلیک ۵۰ درجه ۲ ساعت ۱۰۰-۵۰ برابر حجم نمونه.
الکل اتیلیک ۷۰ درجه ۲ ساعت ۱۰۰-۵۰ برابر حجم نمونه.
الکل اتیلیک ۹۰ درجه ۲ ساعت ۱۰۰-۵۰ برابر حجم نمونه.
الکل اتیلیک ۹۶ درجه ۲ ساعت ۱۰۰-۵۰ برابر حجم نمونه.
الکل اتیلیک مطلق Ι ۲ ساعت ۱۰۰-۵۰ برابر حجم نمونه.
الکل اتیلیک مطلق ΙI 2 ساعت ۱۰۰-۵۰ برابر حجم نمونه.
شفاف سازی:
ماده مدت حجم.
گزیلل I 2 ساعت ۱۰۰-۵۰ برابر حجم نمونه.
گزیلل II 2 ساعت ۱۰۰-۵۰ برابر حجم نمونه.
آغشتگی:
ماده مدت حجم.
پارافین مذاب (۵۶-۶۰ درجه سانتی‌گراد) ۲ ساعت ۵۰-۲۰ برابر حجم نمونه.
پارافین مذاب (۵۶-۶۰ درجه سانتی‌گراد) ۲ ساعت ۵۰-۲۰ برابر حجم نمونه.
قالب گیری :
برای تهیه مقاطع میکروسکوپی از نمونه‌ها که مراحل ثبوت و آماده سازی را گذرانده اند، لازم بود که این نمونه‌ها در بلوک‌های پارافین قالب گیری شوند. برای این منظور از قطعات لوکهارت استفاده شد. این قطعات فلزی به شکل L هستند که با کنار هم گذاشتن آن‌ها می‌توان بلوک‌هایی با حجم‌های گوناگون بدست آورد. برای قالب گیری ابتدا لازم است که پارافین را ذوب نماییم و پارافین مذاب را به درون قالب تهیه شده می‌ریزیم و سپس نمونه بافت را به وسیله یک پنس گرم برداشته در پارافین گذاشته و در جهت مناسب قرار می‌دهیم[۲۷۸]. لازم است که به منظور شناسایی نمونه‌های بافتی قالب گیری شده، بر روی هر یک از بلوک‌های پارافینی تهیه شده، شماره مربوط به هر نمونه نصب شود، بدین ترتیب نمونه در یک بلوک پارافین در بر گرفته شده و آماده برش می‌باشد.
مقطع گیری:
برای تهیه مقاطع میکروسکوپی بافت، از میکروتوم دوار[۲۷۹] استفاده شد و مقاطعی به ضخامت ۵ میکرون تهیه گردید. روی لام چند قطره الکل ۲۰% و سپس یک سری ۶-۴ تایی از مقاطع تهیه شده را روی آن باز شد. سپس لام را به آهستگی به داخل آب ۵۰ درجه سانتی‌گراد به گونه‌ای وارد شد که روی آب شناور گردند و چین و چروک‌ها به خوبی باز و سطح یکنواخت شود. سپس با یک لام دیگر که شماره گذاری شده سریال تهیه شده را از روی آب می‌گیریم. اسلایدها را برای مدت حدود ۱۲۰-۳۰ دقیقه در آون با دمای ۵۶ تا ۵۸ درجه سانتی‌گراد قرار میگیرد تا پارافین مقطع بافتی ذوب شود و علاوه بر آن بافت به خوبی بر روی لام بچسبد و در حین رنگ آمیزی جدا نشود.
رنگ آمیزی[۲۸۰]:
رنگ آمیزی نمونه‌ها بر اساس روش روتین هماتوکسیلین- ائوزین به شرح زیر انجام گردید.
مراحل رنگ آمیزی ۱H&E :

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...