ml 7
Premix

ml 1
Forward

ml 1
Reverse

ml 2
DNA

ml 9
Water

ml 20
Volume

جدول ۳-۲ مقدار مواد مورد نیاز برای ساخت مخلوط PCR

نکته) در این تحقیق از میکروتیوپ های حاوی پرمیکس آماده از شرکت ژن فن آوران استفاده گردید که خود حاوی Taq DNA پلی مراز، dNTP،Mgcl2 و بافر PCR است.
۳ـ۷ـ۳ـ روش کار
ا) در ابتدا چون پرایمر ها خشک هستند (که در این حالت به آن ها استاک گفته می شود.)، به آن مقدار آبی که شرکت سازنده پرایمر بر روی آن نوشته است (بر اساس مقدار OD) اضافه می کنیم. سپس آن را به مدت یک روز در دمای ۲۰- نگه داری کرده و دوباره پرایمر را به نسبت ۱ به ۱۰ رقیق می کنیم (۹۰ میکرولیتر آب، ۱۰ میکرولیتر پرایمر) و برای ساخت محصولات PCR از این پرایمر رقیق شده استفاده می کنیم.
۲) یک میکروتیوپ ۵/۱ میکرولیتری استریل شده آماده کرده تا مخلوط را در آن بسازیم.
۳) میزان حجم هایی که در بالا ذکر گردید (به جز DNA) را در میکروتیوپ ۵/۱ می ریزیم.
۴) در این مرحله ۱۸ میکرولیتر از مخلوط آماده شده را به درون یک میکروتیوپ ۵/۰ میکرولیتری انتقال داده و به مقدار ۲ میکرولیتر DNA به آن اضافه می کنیم.
۵) ۲ تا ۵ ثانیه میکروتیوپ را اسپین داده، سپس سریعا آن را به دستگاه PCR انتقال می دهیم.
نکته) حجم هایی که در بالا ذکر شد برای انجام یک (Reaction) واکنش است. به ازای هر واکنش این حجم ها در تعداد واکنش ها ضرب می شود.
۳ـ۷ـ۴ـ مراحل انجام PCR
با بهره گرفتن از این روش می توانیم چندین کپی از یک رشته DNA داشته باشیم. برای انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز، به الگوی DNA دو رشته ای، DNA پلی مراز، نوکلئوتید و آغازگر نیاز داریم. DNA الگو در درجه حرارت ۹۵-۹۰ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه تکثیر می شود. دو رشته DNA در نتیجه دناتوره شدن از هم جدا میگردد. با اضافه شدن پرایمرها به مخلوط، سنتز DNA آغاز می شود. این مخلوط تحت درجه حرارت ۵۵-۵۰ برای اتصال پرایمر به دو رشته DNA الگوی از هم جدا شده، قرار می گیرد و پلیمریزاسیون آغاز می گردد. برای انجام این مرحله DNA تک پلی مراز و باکتری گرمادوست مورد نیاز است. آنزیم بیش ترین فعالیت خود را در حرارت ۷۵ درجه سانتی گراد دارد. تک پلی مراز به قسمت ′ OH3 متصل می شود و هر یک از رشته های اولیه به عنوان یک الگو برای ایجاد رشته های مکمل DNA استفاده می شود. در این مرحله مقدار DNA دو برابر شده، و این چرخه به طور معمول حدود ۳۰ بار تکرار می شود تا یک میلیارد مولکول را ایجاد کند[۴۱].

Stage
Cycle
Step
Temperature(C°)
Time