۹-۲- شرایط واکنش دوتایی هضم آنزیمی جهت تایید ناقل‏های همسانه‏سازی ((-)pGEM7zf) و (pUC19)…………………………………………………………………………………………………………….. 37
۱۰-۲– شرایط واکنش هضم دوتایی آنزیمی جهت تایید ناقل بیانی(pBI121)…………………….. 37
۱۱-۲- شرایط واکنش هضم آنزیمی ژن hrpW و pBI121 جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل………………………………………………………………………………………………………………………. ۳۸
۱۲-۲– شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل بیانی جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………. ۳۸
۱۳-۲- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpG)………………………………………………………….. 40
۱۴-۲- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpW)…………………………………………………………… 40
۱۵-۲- شرایط واکنش اتصال (pUC19-hrpG)……………………………………………………………. 41
۱۶-۲- شرایط واکنش اتصال (pGEM7zf(-)-hrpW)…………………………………………………… 41
۱۷-۲- چرخه حرارتی به‏کار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانه‏سازی در وکتور بیانی…………………………………………………………………………………………………………………….. ۴۵

۱۸-۲- ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیره‏ای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانه‏سازی دروکتورهای کلونینگ و بیانی…………………………………………………………………………………… ۴۵
۱-۵- مواد و مقدار مورد نیاز جهت تهیه بافر Loading dye……………………………………………… 91
فهرست شکل‏ها
عنوان صفحه
۱-۳- تست بیماریزایی روی لیمو………………………………………………………………………………………………۴۸
۲-۳- تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/MS) Multiplex PCR……………………………………………………..49
۳-۳- اکتروفورزDNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز ۱%………………………………………………..۵۰
 دی.ان.آ پلیمراز و گرادیان دمایی جهت بهینه ‏سازی بهترین دمای اتصال با پرایمرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………………….۵۳
 دی.ان.آ پلیمراز………………………………………………………………………………………………………………………..۵۳
۶-۳- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگ و بیانی با آنزیم‏های برشی نوع II بر روی ژل آگارز ۱%………………………………………………………………………………………………………………………………..۵۴
W جهت بازیابی از روی ژل آگارز)الف) و قطعات بازیابی شده(ب)………………………………………………………………………………………………………………………۵۵
۸-۳- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19 و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز(الف) قطعات بازیابی شده(ب)……………………………………………………………………………………………………………………..۵۵
W……………………………………58
G و pUC19……………………………………………………………………………………………………..58
۱۱-۳- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز پلاسمیدهای تایید شده بر روی ژل آگارز ۱%….۵۹
۱۲-۳- هضم آنزیمی ناقل بیانی جهت بازیابی از روی ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)……..۶۱
W/G جهت تعیین نسبت واکنش اتصال…………..۶۲
W……………………………………………………………………………………………………………………….63
I……………………………………………………………………………………………………………………………..64
W جهت بررسی حضور ژن‏های مذکور……………………………………………………………………………………………………………..۶۵
۱۷-۳- پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شده……………………………………………………………………………..۶۶
W/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس…………………………………………………………………………………………. ۶۸
فصل اول
مقدمه و بررسی منابع
مقدمه
مقدمه‏ای بر مرکبات
مرکبات با نام علمی Citrus spp. از خانواده‌ی Rutaceae و زیرخانواده‌ی Auranutideae هستند. مرکبات گیاهانی بوته‌ای، درختچه‌ای با شاخ و برگ متراکم می‏باشند، اغلب گونه‌های مرکبات (مانند پرتقال^[۱]، گریپ‌فروت^[۲] و دورگ‌های نارنگی^[۳]) در نواحی نیمه‌ گرمسیری با زمستان سرد فقط یک ‌بار در سال در اواخر زمستان و اوایل بهار گل می‌دهند. اما در نواحی گرمسیر و ساحلی ممکن است درختان مرکبات مانند لیموها^[۴] و لایم‌ها که در بهار و تابستان گل می‌دهند، در طول سال چندین مرتبه گل داده و یا اینکه دوره‌ی گلدهی بسیار طولانی داشته باشند (دیویس و همکاران، ۱۹۹۴). در مرکبات گل‌ها ۸-۴ گلبرگ ضخیم سفید، قرمز یا ارغوانی رنگ، ۵-۴ کاسبرگ و ۳۲-۱۶ پرچم دارند. تخمدن دارای ۱۴-۶ برچه‌ی بیضوی متصل به خامه‌ی خیلی باریک و گاهی متورم و پهن بوده که به کلاله‌ی کروی ختم می‌شود. گل‌ها در مرکبات دو جنسی هستند و همچنین نوع گرده‌افشانی مرکبات برحسب گونه متفاوت است و خودگشن، خودگشن- دگرگشن و پارتنوکارپ هستند. به‏عنوان مثال، لیموترش عموماً خودگشن می‌باشد (کاستل و جمیتر، ۱۹۹۹).
میوه‌ی مرکبات غنی از ویتامین‌های A، B، C، فیبر، کربوهیدرات (قندهای ساده، فروکتوز، گلوکز و ساکارز) و مقادیری کلسیم، پتاسیم، نیاسین و اسیدفولیک می‌باشد که موجب پایین آوردن کلسترول خون، پیشگیری از عفونت‌های ویروسی و احتمال بروز سرطان روده و معده می‌شود (گورنستئین و همکاران، ۲۰۰۱). تولید مرکبات در جهان امروز از اهمیت بسزایی برخوردار است و یکی از منابع مهم ثروت، مبادلات تجاری و اشتغال به کار ساکنین حدود ۱۳۷ کشور مرکبات‌خیز جهان به‌شمار می‌آید. حدود یک‏صد صنعت در جهان، از مرکبات در تولید فرآورده‌های خود استفاده می‌کنند. از موارد مهم و قابل توجه در صنعت مرکبات بالا بودن ارزش افزوده‌ی این محصول از طریق تولید محصولات جانبی آن است، که شامل مواد اولیه‌ی دارویی، غذایی و آرایشی و بهداشتی می‌شود (اسماعیل و ژانگ، ۲۰۰۴).
کشت و کار مرکبات بین عرض‌های جغرافیایی ۴۰ درجه‌ی شمالی و جنوبی از خط استوا صورت می‌گیرد که در سطوح تجاری مناطق عمده‌ی تولید مرکبات جهان در بین عرض‌های جغرافیایی ۵/۲۳-۴۰ درجه‌ی شمالی و جنوبی قرار دارند. حداقل حرارت مورد نیاز برای شروع رشد مرکبات (صفر فیزیولوژیک) ۵/۱۲ درجه‌ی سانتی‏گراد و متوسط دمای مناسب جهت رشد مطلوب ۵/۱۸ درجه سانتی‏گراد است، مرکبات ماهیانه به ۱۸۰ ساعت مجموعه‌ی حرارتی نیاز دارند (فتوحی و همکاران، ۱۳۸۵). دما و آب به صورت چشمگیری در تنظیم زمان و دوره‌ی گلدهی، توزیع گل، درصد تشکیل میوه و وضعیت نمو و ریزش میوه‌ی درختان مرکبات تأثیر دارند. مرکبات جهت رشد و نمو در مناطق مرطوب به میزان ۷۵۰ و در مناطق خشک به ۱۵۰۰ میلی‌متر (۱۵ هزار متر مکعب آب در هکتار) آب در سال نیاز دارند (خوشخوی و همکاران، ۱۳۷۳). سرما و یخبندان از جمله مسائل محیطی خطرساز برای مرکبات در کنار بیماری‌ها^[۵] و آفات^[۶] به شمار می‌روند.
بهترین نوع خاک برای کشت و کار مرکبات، خاک شنی- لومی می‌باشد، و همچنین در محدوده‌ی ۵/۵ تا ۵/۷ از pH عملکرد خوبی دارند. در بین محصولات باغی، مرکبات حساس‌ترین گروه به شوری خاک می‌باشند (خوشخوی و همکاران، ۱۳۶۴).
تاریخچه‌ کشت درختان مرکبات در ایران و جهان
منشأ مرکبات را می‌توان جنوب شرق آسیا، چین و مجمع الجزایر هند و از ۲۴۰۰ سال قبل از میلاد مسیح دانست (جمیتر و هو، ۱۹۹۰). از کناره‌های جنوبی دریای مازندران نیز به‏ ‌عنوان دومین کانون گسترش کشت مرکبات نام برده می‌شود (الهی‌نیا ،۱۳۸۳). ورود مرکبات به ایران به جز گونه‌ی بالنگ، سابقه‌ای ۴۰۰ ساله دارد. به استناد مدارک تاریخی، ایران دروازه‌ی خروج مرکبات از آسیا به سایر مناطق جهان بوده است (الهی‏نیا، ۱۳۸۳).
سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهان
بر اساس گزارش آمار مرکبات وزارت کشاورزی در سال ۱۳۹۲، سطح زیر کشت مرکبات کشور در قالب سه ناحیه‏ی مرکزی، شمالی و جنوبی به میزان ۲۸۸۱۰۸ هکتار و میزان تولید ۴۲۹۹۲۴۷ تن بوده است که این آمار نشانگر تمایل جمعیت برای مصرف و در نتیجه لزوم اهمیت بیشتر به تحقیقات و کشت این محصول در راه تامین نیازهای غذایی جمعیت رو به‏ افزایش کشور است.
تولید مرکبات کشور حدود ۴ میلیون تن برآورد شده و ۳/۸۶ درصد آن از اراضی آبی حاصل شده است. راندمان^[۷] تولید مرکبات آبی در کشور ۶/۱۶۹۳۱ کیلوگرم در هکتار است. بیشترین و کمترین عملکرد آبی به ترتیب با ۲/۲۱۸۳۲ و ۷/۴۳۸ کیلوگرم به استان‌های مازندران و لرستان تعلق دارد.
بر اساس آمار فائو در سال ۲۰۰۸، سطح زیر کشت مرکبات در دنیا ۷/۸ میلیون هکتار بوده و میزان متوسط تولید محصول مرکبات جهان ۱۲۲ میلیون تن گزارش شده است. بررسی کشورهای عمده‌ی تولیدکننده‌ی مرکبات نشان‌ می‌دهد که از نظر سطح زیر کشت به ترتیب چین، برزیل، نیجریه، مکزیک، آمریکا، هند، اسپانیا و ایران مقام اول تا هشتم را به خود اختصاص داده‌اند. این در حالی است که براساس میزان تولید مرکبات، کشورهای برزیل، آمریکا، چین، مکزیک، اسپانیا، هند، ایتالیا و ایران به‌ترتیب در رده‌های اول تا هشتم قرار گرفته‌اند (آمار نامه کشاورزی، ۱۳۸۸). از لحاظ عملکرد^[۸] مرکبات نیز به ترتیب آمریکا، ترکیه، آفریقای جنوبی، ژاپن و آرژانتین مقام‌های اول تا پنجم را دارا هستند درحالیکه ایران از این حیث در جایگاه دهم قرار می‌گیرد.
علی‌رغم وجود پتانسیل‌های لازم جهت کشت و کار مرکبات در کشور، اما وجود عوامل محدودکننده و همچنین عدم مدیریت صحیح باعث شده کشور ایران تنها ۴/۰ درصد از سهم تجارت جهانی^[۹] مرکبات را داشته باشد (آمارنامه محصولات باغی، ۱۳۸۷)، که این موضوع نشان‌دهنده‌ی نیاز به انجام مطالعات بیشتر پیرامون این عوامل محدودکننده‌ی زیستی^[۱۰] و غیر زیستی^[۱۱] و مدیریت این عوامل با بهره‌گیری از دانش و تکنولوژی‌های نوین در راستای کاهش اثرگذاری آنها بر کشت و کار، تولید و صادرات این محصول می‌باشد.
اهمیت و انواع بیماری‌های مرکبات
اهمیت بیماری‌های گیاهی برای انسان به علت خساراتی^[۱۲] است که در نتیجه‌ی بیماری به گیاهان و فرآورده‌های آنها وارد می‌شود. بیماری‌های گیاهی ممکن است عامل محدودکننده‌ی کاشت یک گیاه در یک منطقه و یا یک کشور بوده و تمام گیاهان یک گونه را که به بیماری بخصوصی، حساس هستند نابود کند (اشکان، ۱۳۸۵).
علی‌رغم تفاوت‌های موجود از نظر میزان و نوع خسارت‌های مالی ناشی از بیماری‌ها، زارع مطلع و آگاه می‌تواند با بهره گرفتن از بهترین رقم موجود، روش‌های مبارزه‌ی زراعی، بیولوژیکی، ژنتیکی و شیمیایی، نه‌تنها مدیریت مناسبی برای محصول خود داشته باشد، بلکه حتی در سال‌هایی که دیگر باغات ضررهای زیادی متحمل شده‌اند، سود بیشتری بدست آورد.
تریستیزای مرکبات^[۱۳]، اگزوکورتیس مرکبات^[۱۴]، کیسه‌ی صمغی^[۱۵]، جاروی جادوگر^[۱۶]، گرینینگ^[۱۷]، استابورن و شانکر باکتریایی مرکبات^[۱۸] از جمله‌ی بیماری‌های مهم مرکبات در ایران و جهان به‏شمار می‌روند (اشکان، ۱۳۸۵).
تاریخچه و اهمیت بیماری شانکر مرکبات
در بین انواع بیماری‌های مرکبات، از بیماری‏های مهم که توسط عوامل بیماری‌زای باکتریایی رخ می‌دهد بیماری شانکر مرکبات می‌باشد، که در سال‌های اخیر میزان خسارت آن در اغلب کشورهای مرکبات‌خیز جهان از جمله ایران قابل توجه بوده است (گتوالد و سوون، ۲۰۰۲). این بیماری دامنه‌ی میزبانی^[۱۹] وسیعی درگونه‌های گیاهی خانواده‌ی روتاسه دارد که در بین آنها برخی از ارقام مهم تجاری نظیر پرتقال و لیموترش خسارت شدیدی می‌بینند. شدت آلودگی بسته به نوع گونه، رقم و شرایط آب و هوایی مختلف متفاوت است (روزتی، ۱۹۷۷ و سیورولو، ۱۹۸۱ و ۱۹۹۹). شانکر باکتریایی مرکبات به دلیل انتشار و گسترش سریع، ریزش برگ و میوه، خسارت کمی و کیفی میوه و سرخشکیدگی یکی از بیماری‌های آسیب‏رسان مرکبات محسوب می‌شود (داس، ۲۰۰۳).
اختلافاتی بین دانشمندان محقق در این حوزه بر سر منشأ^[۲۰] جغرافیایی این بیماری وجود دارد (داس، ۲۰۰۳). بیماری شانکر مرکبات در سال ۱۸۹۹ برای اولین بار در ژاپن بر روی برگ‏های واشنگتن ناول مشاهده گردید ولی نامی برای آن مشخص نشد (سیورولو، ۱۹۸۱)، برگر و همکاران(۱۹۱۴) شانکر را به‏عنوان بیماری جدیدی معرفی کردند (کویزومی، ۱۹۸۵). اما قدیمی‌ترین آثار از این بیماری مربوط به نمونه‌هایی از بالنگ^[۲۱] در هرباریومی در انگلستان است که بین سال‌های ۱۸۲۷ تا ۱۸۳۱ از هندوستان جمع‌ آوری شده بودند (داس و همکاران، ۲۰۰۳). فاوست و جنکینز (۱۹۳۳) این بیماری را منشأ گرفته از هند و جاوا دانسته‌اند.
این یافته‌ها نشان می‌دهد که منشأ بیماری در مناطق استوایی آسیا مانند جنوب چین، هند و اندونزی می‌باشد و از آنجا به سایر مراکز کشت و کار مرکبات مانند کشورهای حوزه‌ی خلیج فارس و همچنین آمریکا منتقل شده است (دوپسون، ۱۹۴۰). این بیماری همچنین در آمریکا در اوایل قرن بیستم توسط روزتی (۱۹۷۷)، در آفریقای جنوبی توسط Doidge (1916) و در استرالیا توسط Garnsey و همکاران (۱۹۷۹) گزارش شد (داس و همکاران، ۲۰۰۳).
در ایران شانکر آسیایی مرکبات برای اولین بار توسط علیزاده و رحیمیان (۱۳۶۸) در منطقه‌ی کهنوج از توابع استان کرمان بر روی لیمو مکزیکی شناسایی شد (علیزاده و رحیمیان، ۱۹۹۰).
نوع آسیایی شانکر باکتریایی مرکبات (پاتوتیپ A) در سال ۱۹۱۰ از طریق پونسیروس‌هایی^[۲۲] که از ژاپن به‏عنوان نهال بذری، به ایالت فلوریدای آمریکا وارد شد (واترین و همکاران، ۲۰۰۰). در سال ۱۹۱۵ دولت فدرال آمریکا برنامه‌ی خود را در زمینه‌ی ریشه‌کنی این بیماری ابلاغ کرد و برای جلوگیری از شیوع پاتوژن، ریشه‌کنی^[۲۳] درختان آلوده، به صورت قانون فدرال درآمد (لو، ۲۰۱۰). این بیماری احتمالاً از جنوب شرق آسیا به دیگر مناطق تولید کننده‌ی مرکبات انتشار یافته است (شرافتی و همکاران، ۱۳۹۲). علاوه بر ایالات متحده‌ی آمریکا، ریشه‌کنی این بیماری درکشورهای استرالیا، نیوزلند و آفریقای جنوبی هم صورت گرفته است و برنامه‌ی ریشه‌کنی در برزیل و اروگوئه به صورت فعال ادامه دارد (اسچاد و همکاران، ۲۰۰۶). نوع B در آمریکای جنوبی در سال ۱۹۲۳ مورد شناسایی قرار گرفت. این پاتوتیپ در آرژانتین، اروگوئه و احتمالاً پاراگوئه وجود دارد و برای اولین بار از روی لیمو^[۲۴] جدا گردیده است (واترین و همکاران، ۱۹۹۵). پاتوتیپ C از برزیل در سال ۱۹۶۳ و نوع D در سال ۱۹۸۱ از مکزیک از نمونه‏های آلوده جداسازی گردید (اسچاد و همکاران، ۲۰۰۶).