سپس ژل به محلول رنگ‌آمیزی^[۹۲] منتقل و بسته به تازه یا کهنه بودن بافر بین ۳ تا ۵ دقیقه تکان داده شد.
ترکیبات محلول رنگ‌آمیزی:
- حجم ۶۰ سی‌سی اتانول ۱۰%،
- حجم ۳ سی‌سی اسید‌استیک ۵/۰%،
- وزن ۲/۱ گرم نیترات نقره (غلظت نهایی ۲/۰%)،
ژل به‌آرامی خارج شد و با آب مقطر دوبار تقطیر شستشو داده شد،
ژل در محلول ظاهر کننده^[۹۳] قرار گرفت و تا هنگامی‌که باندها مشاهده شوند تکان داده شد.
ترکیبات محلول ظاهر کننده:
-۱۸ گرم هیدروکسید سدیم،
-۳ سی‌سی فرمالدئید ۵/۰%،
پس از ظهور باندها برای جلوگیری از تیرگی و ناخوانا شدن، ژل با آب مقطر شستشو داده شد، به‌وسیله‌ی دوربین عکس از ژل گرفته شد.

۳-۳ تجزیه و تحلیل داده‌های مولکولی
به منظور تجزیه و تحلیل باند‌ها می‌بایست اندازه‌ی باند‌ها مشخص شود که از نرم افزار UV docاستفاده شد. به دلیل نبود نرم‌افزار مناسب برای گیاهان تتراپلوئید محاسبات به‌صورت دستی انجام شد. برای این‌کار از روش‌های ژنتیک مندلی استفاده شد. ابتدا لوکوس‌های پلی‌مورف تعیین و با توجه به باند‌های بدست‌آمده رابطه‌ی بین ۹ درخت والدی ۱۰۱B تا ۱۰۹B با ۳۸ درخت فرزندی تعیین گردید. در این راستا میزان انتقال‌پذیری آغازگر‌ها، شایستگی نسبی درختان والدی و ژن‌های احتمالی مرتبط با یخبندان تعیین گردیدند.
۱-۳-۳ تجزیه خوشه‌ای
در این تحقیق به‌منظور تعیین روابط خویشاوندی بین درخت ‌های مورد بررسی از تجزیه‌ی خوشه‌ای که اساسی‌ترین روش برای تعیین درجه شباهت بین نمونه‌ها می‌باشد، استفاده شد. در این تحقیق برای محاسبه‌ی فاصله‌ها از نرم‌افزار SAS با روش جاکارد استفاده شد و خوشه‌بندی به روشUPGMA در محیط SASانجام شد.
فصل چهارم
بحث و نتایج
فصل چهارم: بحث و نتایج
۱-۴ استخراج DNA
از میان روش‌های مختلف استخراج مورد آزمایش، روش CTAB تغییر یافته مناسب‌ترین نمونه‌ی DNA استخراجی را از نظر غلظت، نداشتن آلودگی پروتئینی و RNA ایجاد کرد.
۲-۴ کیفیت و کمیت DNA استخراج شده
۱-۲-۴ نانودراپ
اندازه‌گیری میزان جذب نور در طول موج‌های۲۳۰، ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر با بهره گرفتن از دستگاه نانودراپ (شکل ۱-۴) غلظت DNA استخراجی را ۴۵۰ نانوگرم بر میکرولیتر نشان داد و با نسبت ۲۸۰/۲۶۰ حدود ۹/۱ عاری از RNA، آلودگی پروتئینی و فنلی و با نسبت ۲۳۰/۲۶۰ حدود ۶/۱ عاری از نمک‌هایی است که در طول استخراج مورد استفاده قرار گرفتند. محدوه‌ی غلظت DNAی مورد استفاده بین ۱۰۰ تا ۶۰۰ نانوگرم بر میکرولیتر متغییر بود.
شکل ۱-۴ تعیین غلظت DNA با بهره گرفتن از نانودراپ
۲-۲-۴ الکتروفورز ژل آگارز
الکتروفورز ۳ میکرولیتر از نمونه‌ی DNA استخراجی در ژل آگارز ۱% یک باند با وزن مولکولی بالا را نشان داد، نوارهای بدون کشیدگی و صاف خلوص بالای DNA، عاری بودن از RNA و عدم شکستگی DNA را تأیید کرد (شکل ۲-۴).
شکل ۲-۴ نمونه‌ی DNA استخراج شده
۳-۴ واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز
همه‌ی ۸ جفت آغازگر به کار گرفته شده قادر به تولید باند بودند. برای به‌دست آوردن دمای مناسب اتصال آغازگر از PCR با شیب دمایی استفاده گردید. بدین ترتیب بهترین دما برای واکنش PCR هر آغازگر تعیین شد (جدول۱-۴). به‌جز آغازگر Mo8 درجه حررات اتصال سایر آغازگر‌ها کمتر از درجه حررات‌های گزارش‌شده بود. این اثر ناشی از این است که احتمالاً توالی‌های مجاور ریزماهواره‌های کهور پاکستانی دارای جهش‌هایی هستند که باعث شده است اتصال در درجه حرارت‌های بالاتر گزارش‌شده صورت نگیرد.
جدول۱-۴ شرایط بهینه شده واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز برای هر آغازگر