محصولPCR 10 میکرولیتر
بافر رقیق کننده 2 میکرولیتر
آنزیم BseNI 1میکرولیتر
H₂O 17میکرولیتر

حجم کل 30 میکرولیتر

بعد از افزودن مخلوط نهایی به میکروتیوتیپ­ها و سانتریفوژ کردن نمونه­ها را به مدت 16 ساعت در دمای 65 درجه برای آنزیم BseNI، و به مدت 16 ساعت در دمای 37 درجه برای آنزیم CfrI، در داخل بن­ماری گذاشته شد. سپس مقدار 10 میکرولیتر از محصول هضم روی ژل آگارز 3 درصد بارگذاری شد و برای تشخیص اندازه باندها سایز مارکر 100 به کار برده شد. نمونه­ها به مدت 80 دقیقه در 90 ولت الکتروفورز گردید. سپس با بهره گرفتن از دستگاه ژل­داک از ژل عکس برداری گردید.

3-9 تجزیه آماری ژنوتیپ­ها
پس از اتمام کارهای آزمایشگاهی و تعیین ژنوتیپ تمام نمونه­ها، کلیه داده ­ها وارد Excel شده سپس با نرم­افزار GenAlex آنالیز گردید سپس فراوانی آللی، ژنوتیپی، وجود تعادل هاردی- وینبرگ مورد بررسی قرار گرفت.
.
فصل چهارم
نتایج و بحث
فصل چهار
نتایج و بحث
4-1 استخراج دی. اِن. اِ
موفقیت در اجرای تکنیک­های مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی منوط بر داشتن منبع دی. اِن. اِ مطلوب و عاری از هر گونه ناخالصی است. دی. اِن. اِ استخراج شده پس از استفاده از RNAas و تعیین کمیت و کیفیت به وسیله نانودراپ (شکل 4-2) بر روی ژل آگارز برده شد و نتایج نشان داد دی. اِن. اِ فاقد هرگونه آلودگی پروتئینی، آلودگی به RNA و شکستگی می­باشد. هم­چنین بررسی غلظت دی. اِن. اِ با بهره گرفتن از نانودراپ نشان داد که دی. اِن. اِ استخراج شده در حدود 100-300 نانوگرم بر میکرولیتر می­باشد و استخراج دی. اِن. اِ به این روش غلظت مناسبی از دی. اِن. اِ را جهت واکنش زنجیره­ای پلیمراز فراهم نموده است. شکل 4-1 کیفیت ژنوم برخی از نمونه­های مورد مطالعه را بر روی ژل آگارز به تصویر کشیده است.

شکل 4-1 کیفیت دی. اِن. اِ استخراج شده بر روی ژل آگارز
شکل 4-2 بررسی کمیت و کیفیت یک نمونه­ دی. اِن. اِ با بهره گرفتن از نانودراپ
4-2 نتیجه واکنش PCR
نتیجه واکنش زنجیره­ای پلیمراز گیرنده­ی یک ژن دوپامین در تصویر 4-4 نشان داده شده است. در این تحقیق همانطور که انتظار می­رفت قطعه 283 جفت بازی از ژن دوپامین در دمای اتصال 4/58 درجه سانتی ­گراد تکثیر شد. جهت تایید اندازه قطعه حاصله، از سایز مارکر 100 استفاده گردید. نتایج حاصل از الکتروفورز نشان داد که قطعه­ی 283 جفت بازی گیرنده­ی یک ژن دوپامین به صورت اختصاصی تکثیر یافت و هیچ گونه باند غیر اختصاصی مشاهده نگردید.
در شکل 4-3 توالی گیرنده­ی یک ژن دوپامین در طیور را مشاهده می­کنیم که به وسیله نرم­افزار Vector NTI پرایمر به آن متصل گردیده است.
شکل 4-3 توالی گیرنده 1 ژن دوپامین و نحوه­ چسبیدن پرایمر به آن
شکل 4-4 محصولات PCR(قطعه 283 جفت بازی)، بر روی ژل آگارز 5/1 درصد جهت تایید اندازه قطعه M سایز مارکر100 استفاده شد.
4-3 برش آنزیمی
قطعه 283 جفت بازی تکثیر شده از گیرنده­ی یک ژن دوپامین توسط دو آنزیم محدود کننده CfrI و BseNI هضم گردید که نتایج هر کدام از آنزیم­ها در زیر شرح داده شده است.
4-4 معیارهای چند شکلی گیرنده­ی یک ژن دوپامین به وسیله آنزیم CfrI
محصولات آنزیمی که با بهره گرفتن از آنزیم CfrI به دست آمده بود بعد از برده شدن بر روی ژل 5/2 درصد سه الگوی باندی AA، GG، و AG در مرغ­های بومی استان خوزستان را نشان داد (شکل 4-5).
محل برشی آنزیم:CfrI
5’…G↓G N C C…3’
3’…C C N G↑G…5’
شکل 4-5 ژنوتیپ­های مختلف AA، AG و GG در شش نمونه مرغ بر اساس هضم آنزیمی قطعه 283 جفت بازی با آنزیم CfrI بر روی ژل آگارز 5/2 درصد. چاهک M سایز مارکر 100، چاهک L1 تا L6 محصول هضم قطعه تکثیر شده از شش مرغ
4-4-1 بررسی تنوع ژنتیکی گیرنده­ی یک ژن دوپامین با آنزیم CfrI
الگوی الکتروفورزی حاصل از هضم قطعه 283 جفت بازی گیرنده­ی یک ژن دوپامین مرغ­های بومی استان خوزستان توسط آنزیم برشیCfrI سه الگوی باندی را مشخص گردانید. دو آلل G و A و سه ژنوتیپ GG، AA و AG به دست آمد. ژنوتیپ AG نسبت به دو ژنوتیپ AA و GG فراوانی بالاتری را نشان داد. نتایج مشاهده شده در این تحقیق با نتایج تمپفلای و همکاران (2015)، وانگ و همکاران (2014)، زوا و همکاران (2011)، فیدلر و همکاران (2007) و سوجیاما و همکاران (2004)، مطابقت داشت. در گزارش وانگ و همکاران (2014) در غاز ضمن اینکه دو آلل G و A را شناسایی کردند اما بیان کردند که فقط دو نوع ژنوتیپ GG(قطعه بدون برش) و GAمشاهده شده است و هیچکدام از نمونه ژنوتیپ AA را نشان ندادند. در گزارشی سوجیاما و همکارانش بیان کردند که فقط چند شکلی در مرغ قابل مشاهده است و چند شکلی در سایر پرندگانی که مورد بررسی قرار گرفته بودند دیده نشد. زوا و همکاران (2010) نیز در ناحیه دیگری از ژن دوپامین، علاوه بر شناسایی دو آلل G و A، آلل C، T و ژنوتیپ­های CT، TT و CCرا نیز مشاهده کردند که در این تحقیق مشاهده نگردید که دلیل آن می ­تواند در نوع آغازگرهای انتخابی و آنزیمی که برای عمل هضم از آن استفاده شده است باشد. وانگ و همکاران (2012) نیز در پژوهشی بر روی اردک به وجود دو آلل A و T اشاره کردند. این محققان سه ژنوتیپ AA، TT و AT را گزارش کردند. بنوانکیان و همکاران (1391)، تنوع ژنتیکی مرغ­های بومی خوزستان را با بهره گرفتن از نشانگرهای ریز ماهواره­ای مورد بررسی قرار دادند و در نهایت اظهار داشتند که توده­های مرغ بومی استان خوزستان دارای تنوع ژنتیکی بسیار بالایی می­باشند، به طوری که تنوع موجود، از تنوع درون و بین جمعیت­ها منشا گرفته است. همچنین ایسوندی و همکاران (1394)، گزارش کردند که ژن پرولاکتین دارای چند شکلی بالایی می­باشد. دریک مطالعه­ دیگری دارابی و همکاران (1386)، بیان کرد در ژن هورمون رشد هتروزیگوستی بالایی وجود دارد. در مجموع این تنوع بالا نشان دهنده اهمیت این توده­ی مرغ بومی خوزستان می­باشد و می­توان در کارهای اصلاح­نژادی از آن استفاده کرد که اگر برنامه ­های اصلاح­نژادی درست و با برنامه­ ریزی صورت گیرد این تنوع درون جمعیتی حفظ می­گردد و می­توان ازآن در جهت توسعه صفات مطلوب استفاده کرد.
در دو تحقیق جداگانه تمپفلای و همکاران (2015) با زوا و همکاران (2010) بیان کردند که جهش در ناحیه G+123A گیرنده­ی یک ژن دوپامین بر تولید تخم و شدت آن تاثیر معنی دارد. درواقع بیان کردند در مرغ­های تخمگذاری که این جهش یافت شد مقدار تولید نسبت به بقیه مرغ­ها بالاتر بوده است. از آنجایی که این جهش نیز در مرغ­های بومی خوزستان دیده شد می­توان با یک برنامه اصلاحی مناسب جهت به­گزینی، مرغ­هایی که داری این جهش هستند را به عنوان والدین نسل آینده انتخاب کرد و در نهایت تولید را افزایش داد.
4-4-2 فراوانی آللی گیرنده یک ژن دوپامین با آنزیم CfrI
در این تحقیق با بهره گرفتن از آنزیم برشی CfrI دو آلل Aو G و سه ژنوتیپ AA، GG، و AGبه دست آمد که در جدول (4-1) فراوانی آن­ها آورده شده است. ژنوتیپ AG بیشترین و ژنوتیپ GG کمترین فراوانی را نشان دادند. آلل A بیشترین و آلل G کمترین فراوانی را نشان داد. سودمندی یک نشانگر ژنتیکی به تعداد و فراوانی آللی آن مربوط می­ شود که این فاکتورها در میزان هتروزیگوسیتی و چند شکلی آن تاثیر دارند. فراوانی آللی به دلیل استفاده از داده ­های خام، نمونه ­ای تصادفی از ژنوم بوده و معیار مناسبی در بررسی تنوع ژنتیکی با بهره گرفتن از نشانگرها می­باشد (لابات^[103]، 2000). آلل A با61/0 دارای بیشترین فراوانی بود و آلل G با 39/0کمترین فراوانی را داشت که با زوا و همکاران (2010) مطابقت داشت ولی با تمپفلای و همکاران (2015)، مطابقت نداشت. در واقع مشاهدات تمپفلای عکس گزارش ما بود که شاید بتوان دلیل تفاوت فراوانی آللی با مشاهدات تمپفلای را در نوع آنزیم محدود کننده ­ای که استفاده شده ربط داد. از آنجایی که هر آنزیم محدودکننده یک جایگاه برشی خاصی دارد بنابراین می­توانند نتایج متفاوتی را نشان دهند و همچنین تفاوت می ­تواند در جمعیت­های که مورد مطالعه قرار گرفته­اند باشد.
جدول 4-1 فراوانی­های ژنوتیپی و آللی گیرنده­ی یک ژن دوپامین با آنزیم cfrI در مرغ­های بومی استان خوزستان

تعداد ژنوتیپ و آلل فراوانی­ها