۵-اثر بافرکلرید سدیم-گلایسین بر افزایش حلالیت: مطابق مطالعات، جذب نوری در حضور بافر گلایسین همراه دی متیل سولفوکسید بیستر از دی متیل سولفوکسید به تنهایی است.
۶-اثر PH بافرگلایسین بر حلالیت فورمازان: اگر فورمازون تنها در دی متیل سولفوکسید حل شود فقط دو جذب ماکزیمم می‌دهد ۵۱۰ و۵۷۰ نانومتر. در صورتیکه افزایش یابد منحنی به سمت راست متمایل می‌شود و فقط یک ماکزیمم می‌دهد، این ماکزیمم در۵/۱۰PH= اتفاق می‌افتد.
^[۱]MTS، ترکیب مشتقی از MTT می­باشد که خصوصیات فیزیکوشیمیایی مناسب­تری دارد. مهم­ترین ویژگی­های ارزیابی سمیت سلولی به وسیله­ این ترکیب، سهولت استفاده، صحت بالا و شناسایی سریع سمیت می­باشد(۷۴).
بعد از کشت سلول­ها و در معرض قرار دادن آنها با عصاره­ها به مدت ۴۸ ساعت و در پلیت­های ۹۶ خانه، انکوباسیون سلول­ها (در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد واجد ۵٪ CO₂) با محلول MTS به مدت ۴ ساعت انجام می‌شود. جذب این نمونه‌ها با کمک ELISA reader در طول موج ۴۹۰ نانومتر خوانده می‌شود. این جذب متناسب با میزان سلول‌های زنده می‌باشد (قانون بیر – لامبرت).
در این مطالعه، از کیت تعیین کمی رشد و تکثیر سلولی برپایه MTT شرکت سیگما (Sigma) استفاده گردید. تعداد پنج هزار سلول در داخل هر چاهک از پلیت ۲۴ خانه کشت داده شد. ظرف کشت مذکور به‌مدت یک روز در انکوباتور با دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و ۵ درصد دی‌اکسید کربن قرار داده شد تا سلولهای فیبروبلاستی بخوبی به پلیت بچسبند. آزمون MTT در ساعات ۲۴ تا ۷۲ ساعت پس از تابش لیزر انجام گرفت. بدین منظور در زمان مد نظر به هر چاهک پلیت، معادل ۱۰% حجم محیط کشت (۱۰۰ میکرولیتر) از محلول استریل MTT با غلظت ۵ میلی گرم در میلی لیتر اضافه شد و ظرف کشت به مدت ۳ ساعت در داخل انکوباتور قرار گرفت. بعد از تشکیل بلور‌های فورمازان، از محلول۱/۰ نرمالHCL در ایزوپروپانول به عنوان حلال استفاده شد. بعد از پیپتاژ کامل و حل شدن بلورها، جذب محلول بنفش رنگ به‌دست آمده در طول موج ۵۷۰ نانومتر اندازه‌گیری گردید. از سلولهای فیبروبلاستی که به آنها تابش لیزر انجام نشده بود به‌عنوان کنترل استفاده شد.

آزمون Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

از این آزمون جهت تعیین بیان ژنهای نشانگر فعالیت فیبروبلاست استفاده شد. این آزمون در سه مرحله انجام می گردد: تخلیص RNA، سنتز cDNA و انجام RT-PCR
الف- تخلیص RNA:
از سلولهای گروه های تست و کنترل به این روش RNA جداسازی شد: برای تخلیص RNA، به پلیت سلولی حاوی ۱ میلیون سلول، حجم ml 1 از محلول Trizol(QIAGEN) اضافه شده به مدت ۵دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردید. محلول هموژن به لوله های اپندورف منتقل گردیده و یک پنجم حجم، کلروفرم به آن اضافه شد و لوله به مدت ۳۰ ثانیه شدیداً تکان داده شده و سپس ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت. سپس با سرعت ۱۲۰۰۰دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ انجام گرفت. پس از سانتریفوژ ۲ لایه تشکیل گردید که لایه بی رنگ بالائی حاوی RNA ولایه پائینی حاوی DNAو پروتئین می باشد. فاز بالایی که حامل RNA است با دقت زیاد و با بهره گرفتن از سر سمپلر های RNase free برداشته شده و به لوله جدید عاری از RNase منتقل شد. سپس ml 5/0 ایزوپروپانل به لوله های محلول RNA اضافه شده و لوله ها ۱ ساعت در فریزر c ˚۸۰- قرار داده شدند و پس از آن بلافاصله با سرعت ۱۲۰۰۰دور در دقیقه در دمای c ˚۴ به مدت ۱۰دقیقه سانتریفوژ انجام گردید. با دور ریختن مایع روئی رسوب RNA در ته لوله بدست می آید. زدودن باقیمانده های فنل با اضافه کردن ml1 اتانل ۷۵درصد به رسوب RNA و سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه در ۱۲۰۰۰دور در دقیقه در دمای c˚۴ انجام گرفت. در پایان RNA بدست آمده در µl 30 آب مقطر عاری از RNase حل شده و RNA تا در زمان سنتز cDNA در دمای ۷۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد.

ب- سنتز cDNA:
جهت سنتز cDNA از کیت سنتز cDNA شرکت Fermentas استفاده گردید. ۵ میکروگرم از محصول RNA استخراج شده در هر لوله طی مراحل زیر تبدیل به cDNA می گردد:
۵ میکروگرم از RNA را با ۲/۰میکروگرم راندوم هگزامر مخلوط کرده و با آب عاری از ریبونوکلئاز به حجم ۱۱ میکرولیتر رسانده شد .
مخلوط فوق در⁰ C 70 برای ۵ دقیقه انکوبه شد و سپس فورا بر روی یخ منتقل شد.
به مخلوط فوق بافر RT X 5 به میزان ۴ میکرولیتر،dNTP 10Mm به میزان ۲ میکرولیتر و Ribonucleas Inhibitor به میزان ۲۰ واحد و آنزیم RT به میزان µl 1 اضافه و حجم کل به ۲۰ میکرولیتر رسانده شد.
مخلوط فوق به مدت ۱۰ دقیقه در⁰ C 25 سپس به مدت ۶۰ دقیقه در⁰ C 42 و در انتها به منظور غیرفعالسازی آنزیم RT به مدت ۵ دقیقه در⁰ C 70 انکوبه گردید.
cDNA حاصل یا به طور مستقیم در واکنشهایRT-PCR مورد استفاده قرار گرفت و یا در فریزر⁰ C 20- جهت استفاده های بعدی ذخیره گردید.
ج- RT-PCR
RT-PCR با بهره گرفتن از دستگاه Corbett Rotor Gene 6000 ) Real-Time PCR) انجام گرفت. به این منظور بر روی cDNA حاصل از گروه های تست و کنترل، PCR با پروفایل پیشنهاد شده توسط شرکت سازنده Mastermix (Fermentas) انجام گرفت. برنامه دمایی دستگاه شامل یک سیکل ۱۰ دقیقه ای انکوباسیون در دمای ۹۵ درجه سانتی گراد، و ۴۰ سیکل با پروفایل دمایی ۱۵ ثانیه ۹۵ درجه سانتی گراد، ۲۰ ثانیه ۶۰ درجه سانتی گراد و ۳۰ ثانیه ۷۲ درجه سانتی گراد تنظیم گردید . ژنهای مورد بررسی در این آزمون، ژن بسیار مهم نشانگر فعالیت فیبروبلاست کلاژن نوع یک بود. حجم مورد استفاده از مواد مورد نیاز در این آزمون در جدول زیر گردآوری شده است. آنالیز بیان ژن و معناداری نتایج این آزمون با کمک نرم افزار آنالیز کننده دستگاه (REST 2009 Software) انجام گرفت.
جدول ۳-۱ مواد مورد استفاده در RT-PCR

مشخصات پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول زیر به نمایش در آمده است.
جدول ۳-۲ مشخصات پرایمر های مورد استفاده در مطالعه