در سیکل اول اندازه دو رشته به وجود آمده بزرگتر از سکانس واقعی مورد­نظر است. چرا که در فرمان داده شده جهت ساخت رشته مکمل، DNA پلی مراز از انتهای سکانس مورد نظر جلوتر رفته، محصول PCR بزرگتر از سکانس مورد نظر را تولید می­ کند با این وجود، بعد از سیکل دوم، فرآورده ­های حاصل دارای اندازه مورد نظر هستند که به آن­ها محصول کوتاه (Short PCR Product of PCR) هم گفته می­ شود. هم اندازه با طول سکانس مورد نظر هستند )یعنی از ابتدای پرایمر دوم).
مواد مورد نیاز برای انجام واکنش PCR
دانلود پایان نامه - مقاله - پروژه

 

    1. dNTP­ ها از شرکت سیناژن تهیه شدند که حاوی ۵۰۰ میکرولیتر از محلول ترکیب شده نوکلئوتیدهای dGTP و dTTP و dATP و dCTP با غلظت ۱۰ میلی­مول بودند. نگهداری آنها در فریزر ۲۰- صورت گرفت.

 

    1. کلرید منیزیم(MgCl2)

 

محلول کلرید منیزیم از شرکت سیناژن تهیه شد. این محلول با غلظت ۵۰ میلی­مول و بدون رقیق کردن مورد استفاده قرار گرفت. به ازای هر نمونه در واکنش ۲۵ میکرولیتری، ۱ میکرولیتر از این محلول استفاده شد.

 

    1. بافر واکنش PCR

 

بافر واکنش از شرکت سیناژن تهیه شد. بافر واکنش حاوی ۵۰۰ میلی­مول کلرید پتاسیم و ۲۰۰ میلی­مول تریس- اسید کلریدریک با PH=8 بود. غلظت این محلول به صورت ۱۰X می­باشد و بدون رقیق کردن در واکنش PCR استفاده می­ شود. بافر واکنش نیز در فریزر ۲۰- نگهداری شده و قبل از استفاده ذوب شده و پس از استفاده دوباره به فریزر ۲۰- منتقل می­ شود. به ازای هر نمونه در واکنش ۲۵ میکرولیتری، ۵/۲ میکرولیتر از این محلول استفاده شد.

 

    1. آنزیم Taq Polymerase

 

تیوب­ این آنزیم حاوی ۱۰۰ واحد از این آنزیم است. این آنزیم بطور مستقیم در واکنش PCR مورد استفاده قرار می­گیرد. نگهداری این آنزیم در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد است و برای استفاده بایستی بر روی یخ قرار گیرد. به ازای هر نمونه در واکنش ۲۵ میکرولیتری ۳/۰ میکرولیتر استفاده می­ شود.

 

    1. آب دوبار تقطیر شده استریل

 

از آب مقطرهای درون شیشه­های آمپول که به صورت استریل و دوبار تقطیر شده عرضه می­گردد، استفاده می­ شود.
به جای مواد بالا نیز گاهی از مستر میکس آماده نیز استفاده شده که از شرکت به آزما خریداری شده و حاوی همه مواد بالا نیز می­باشد و فقط کافی است به آن پرایمرها و نمونه DNA را بزنیم.

 

    1. پرایمر(آغازگر)

 

همان طور که در توضیح مکانیسم PCR 24 بازی می باشند که به نقاط مکمل گفته شد، پرایمرها یک رشته نوکلئوتیدی ۱۸ خود بر روی رشته الگو متصل شده و سبب مشخص شدن ناحیه تکثیر مورد نظر می شوند. در واقع علاوه بر عمل گفته شده، پرایمر ها گروه –OH 3′ مورد نیاز جهت عمل پلی مرازی آنزیم را در واکنش PCR فراهم می­آورند. در طراحی و بهینه سازی پرایمرها مواردی باید رعایت شود تا بتوانیم از اتصالات غیر اختصاصی جلوگیری نماییم. مشخصات پرایمرهای RAPD در جدول ۳-۴ نشان داده شده است.
جدول ۳-۶ مشخصات پرایمرهای RAPD
جدول ‏۳‑۴ مشخصات پرایمرهای RAPD

 

دمای ذوب (c˚) توالی نام آغازگر
۳۴ ‘-GTGAGGCGTC-3′5 OPC-02
۳۲ ‘-AAAGCTGCGG-3′5 OPC-11
۳۲ ‘-GACGGATCAG-3′5 OP C-15
موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...