۱۹٫۶±۲٫۵

۹۷٫۹±۷٫۹

۱۱۷٫۵±۹٫۵

۱۶٫۵±۰٫۰۱^a

شمارههایی با حروف کوچک a,b بالانویس متفاوت در یک ستون متفاوت به طور قابل توجهی معنی دار میباشد(P ≤ ۰٫۰۱).
۴-۲-۳- گروه آزمایشی هفتم، یا گروه کنترل، در این گروه تخمک ها منجمد نشده و هیچ آلدوسترونی نیز به آنها افزوده نشد. بدیهی است شاخص های تکاملی و کیفی سایر گروه های تخمک های غیر منجمد با این گروه مقایسه گردیدند.
۴-۳- میزان بیان پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در گروه های آزمایشی
در این مطالعه در میزان بیان زیر واحدهای پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در گروه های مختلف تفاوت معنی داری مشاهده گردید که در نمودار ۴-۱ نشان داده شده است. میزان بیان زیر واحد β_۱ پمپ Na⁺/K⁺/ATPase، در گروه هایی که آلدوسترون به آنها در روز چهارم کشت جنینی افزوده شده بود چه در تخمک های منجمد (Vit-D4) و چه در تخمک های تازه (D4)، به طور معنی داری بیشتر از گروه های کنترل آنها بود (P= 0.003 و P=0.001، به ترتیب).
نمودار۴-۱- تاثیر آلدسترون روی بیان زیرواحد های α_۱ و β_۱ پمپ ATPase سدیم و پتاسیم در مدت IVM یا IVC – روز چهارم- در محیط کشت سلولهای بلاستوسیت. نوارها با حروف مختلف نشان دهنده تفاوت معنیدار میباشد(p ≤ ۰٫۰۱).
فصل پنجم
بحث و پیشنهادات
بحث:
در مطالعه ای که اسنیرینگر در سال ۲۰۱۱ انجام داد، نشان داد که مقادیر بالای آلدوسترون در مایع فولیکولی انسان، به خصوص در فولیکول های بزرگ مشاهده می گردد. همچنین او به وجود گیرنده های آلدوسترون بر روی سطح تخمک انسان اشاره نمود. بدین ترتیب او بیان نمود که آلدوسترون یکی از اجزای فعال سیستم رنین- آنژیوتانسین- آلدوسترون تخمدانی است که شاید مقادیر مختلف آن بتواند به عنوان شاخصی جهت پیش آگهی باروری افراد در آینده، مورد استفاده قرار گیرد ]۱۴۹[. آلدوسترون از طریق دو مکانیسم مولکولی بر روی نسخه بردای ژن ها تأثیر می گذارد: اول، روش کلاسیک و دوم، تعامل پروتیین- پروتیین. در روش کلاسیک کمپلکس استرویید- گیرنده به طور مستقیم به DNA ژنومی متصل شده و بدین ترتیب از طریق تحریک و یا مهار رونویسی موجب افزایش یا کاهش بیان ژن می گردد. در روش دوم، گیرنده های استروییدی بر روی یک سری واسطه های پروتیینی وجود دارند و آلدوسترون از این طریق با DNA باند می شود که در این روش، تنظیم بیان ژن بدون نیاز به گیرنده استروییدی بر روی DNA و از طریق این ترکیب پروتیین- پروتیین انجام می شود. برخی از مهمترین پروتیین هایی که آلدوسترون جهت اعمال اثرات خود با آنها باند می شود عبارتند از: دی اسیل گلیسرول (DAG)، اینوزیتول تری فسفات (IP3)، پروتیین کیناز C (PKC) و cAMP ]18[.
مطالعات نشان می دهند که در تخمک های منجمد- ذوب شده، آسیب های فراساختاری، مورفولوژیک، فیزیولوژیک و عملکردی متعددی به چشم می خورد که مهم ترین آنها عبارتند از: وارد شدن صدمات غیرقابل برگشت به غشاء پلاسمایی تخمک و غشای برخی ارگانل ها مانند میتوکندری ها (به عنوان منابع انرژی سلولی)، کاهش نفوذپذیری انتخابی غشاء پلاسمایی، اگزوسیتوز زودرس گرانول های کورتیکال، سفت و سخت شدن زوناپلوسیدا، کاهش شدید میکروویلی ها، بهم ریختگی شدیداووپلاسم، تغییرات شدید و کاهش مشخص دستجات میکروتوبول ها و میکروفیلامان ها، بهم ریختگی دوک تقسیم و حرکت اجزاء اطراف سانتریول ها به مرکز تخمک، خرد شدن هسته، افزایش احتمال پارتنوژنزیس، کاهش شدید MPF، کاهش مشخص برخی ترنسکریپت ها، متابولیت ها، منابع انرژی سلولی و پروتئین ها، آنپلوییدی و پلی پلوییدی ]۲۰[.
در مطالعه ای که سوکو در سال ۲۰۰۸ به منظور بررسی تأثیر انجماد تخمک های گوسفندی بر میزان بیان ترنسکریپت ها در جنین های حاصله از این تخمک ها انجام داد، مشاهده نمود که میزان ترنسکریپت پمپ Na⁺/K⁺/ATPase به طور معنی داری در جنین های حاصل از تخمک های منجمد شده، نسبت به گروه کنترل (تخمک های غیر منجمد)، کاهش یافت ]۱۵۳[.
پژوهش های انجام شده به منظور بررسی نقش پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در روند شکل گیری بلاستوسیست ها نکاتی را بیان میکنند که مهمترین آنها عبارتند از: الف- پمپ های مذکور دقیقاً قبل از
شکل گیری حفره بلاستوسل، به صورت قطبی شده (Polarized) و محدود در غشای بازولترال (قاعده ای- جانبی) تروفکتودرم، توزیع می گردند ]۱۷۳،۹[، ب- میزان بیان ژنی تحت واحدهای پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در طی انتقال از مرحله مورولا به بلاستوسیست افزایش می بابد (۷-۳)، ج- میزان فعالیت پمپ Na⁺/K⁺/ATPase به طور معنی داری در طی انتقال از مرحله مورولا به بلاستوسیت تا ۹ برابر افزایش می یابد ]۱۶۴،۵۶[. د- تیمار با اوباین (Ouabain) {مهار کننده قوی و اختصاصی پمپ Na⁺/K⁺/ATPase} موجب کاهش تشکیل حفره بلاستوسل و درصد بلاستوسیست در برخی گونه ها گردیده است ] ۱۰،۱۱[، ه- پمپ Na⁺/K⁺/ATPase موجب تنظیم شکل گیری و عملکرد اتصالات (tight junction) سلول های تروفکتودرم می گردد. مطالعات نشان داده اند که احتمالاً پمپ Na⁺/K⁺/ATPase به طور مستقیم موجب تنظیم مکانیسم های دخیل در جابجایی مایعات در تروفکتودرم که منجر به شکل گیری حفره مملو از مایع بلاستوسیست می شود، می گردد.
مطالعات متعدد حاکی از افزایش مقادیر mRNA و نیز پروتیین تحت واحدهای α و β پمپ های Na⁺/K⁺/ATPase، تحت تأثیر افزودن آلدوسترون در سلول های مختلف کشت داده شده در شرایط آزمایشگاهی می باشند، به عنوان مثال مواجهه سلول های قلبی موش صحرایی با آلدوسترون، موجب افزایش سه برابری در مقادیر mRNA تحت واحد α در مدت ۶ ساعت گردید ]۱۱۵[. در مطالعه دیگر در سلول های کلیوی کشت داده شده (A6)، آلدوسترون موجب افزایش ۵/۲ برابری در مقادیر mRNA تحت واحد _۱β گردید، لیکن هیچ تأثیری بر مقادیر mRNA تحت واحد _۱α پس از ۳ ساعت مواجهه نداشت ]۹۰[. در مطالعه ای دیگر، وری (Verrey et al., 1989) نشان داد که افزودن nM300 آلدوسترون در محیط کشت سلول های A6 کلیوی، در طول ۶ ساعت، موجب افزایش ۴ برابری در مقادیر mRNA تحت واحد _۱β ومیز افزایش دو برابری در مقادیر mRNA تحت واحد _۱α پمپ مذکور گردید. در این مطالعه نشان داده شده است که احتمالاً آلدوسترون با تأثیر مستقیم بر روی ترکیب هورمون-گیرنده و تحریک پروموتر ژن Na⁺/K⁺/ATPase موجب افزایش نسخه برداری و مقادیر mRNA ژن مذکور می گردد ]۱۶۵[. همچنین در مطالعات دیگر نشان داده شده است Na⁺/K⁺/ATPase نقش مهمی در مرحله تفریخ بلاستوسیست دارد، بدین ترتیب که افزایش فعالیت پمپ مذکور و متعاقباً افزایش مایعات داخل بلاستوسل، موجب افزایش حجم سلول و پاره شدن زونا پلوسیدا می گردد]۱۷۳[.
بر اساس نتایج مطالعه حاضر، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمکهای غیر منجمد موجب افزایش میزان تفریخ بلاستوسیست ها در روز ۸ کشت جنینی، نسبت به گروه کنترل گردید، لیکن تفاوت معنیداری در درصد بلاستوسیستها نسبت به گروه کنترل دیده نشد. در مطالعات دیگر نیز نشان داده شده است که افزودن طیف مختلفی از ترکیبات آنتی اکسیدان (توکوفرول و اسید آسکوربیک)، فاکتورهای رشد (مانند EGF، IGF) و هورمون ها (مانند FSH و LH)، موجب افزایش توانمندی تخمک ها در مرحله IVM، و متعاقباً بهبود روند تکاملی جنین های حاصله خواهد گردید]۶۶[. بدین ترتیب همان طور که اشاره گردید با توجه به افزایش فعالیت فیزیولوژیک پمپ مذکور در مرحله تفریخ جنینی، به نظر می رسد آلدوسترون با افزایش بیان پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در تخمک های گوسفندی، نقش موثری در افزایش میزان تفریخ بلاستوسیست ها داشته باشد. همچنین همان طور که اشاره گردید، تعداد کلی سلول ها در گروه تحت تیمار با آلدوستورن به طور معنی داری بیشتر از گروه کنترل بود که شاید با نقش آلدوسترون در افزایش مقادیر cAMP سلولی که بیانگر افزایش منابع انرژی سلولی می باشد در ارتباط باشد، چرا که یکی از مشکلات کشت جنین در شرایط آزمایشگاهی، تأمین مقادیر مناسب منابع انرژی، در زمان های مختلف تکامل جنین می باشد.
در مطالعه حاضر، افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی (D4)، به محیط کشت جنینهای تخمکهای غیر منجمد، موجب افزایش معنی دار میزان تفریخ بلاستوسیست ها در روز ۸ کشت جنینی شد ، لیکن تفاوت معنیداری در درصد بلاستوسیستها نسبت به گروه کنترل دیده نشد. بدین ترتیب با توجه به آغاز فعال شدن ژنوم جنینی در روزهای ۵ و ۶ کشت جنینی در گوسفند، انتظار می رود آلدوسترون با القای ژن Na⁺/K⁺/ATPase در انتهای روز چهارم کشت جنینی، موجب افزایش بیان پروتیین مذکور و متعاقباً افزایش توانمندی تفریخ بلاستوسیست ها در روز ۸ جنینی گردد. همچنین تعداد کلی سلول ها در گروه تحت تیمار با آلدوستورن به طور معنی داری بیشتر از گروه کنترل بود که همان گونه که ذکر گردید، شاید با نقش آلدوسترون در افزایش مقادیر cAMP سلولی در ارتباط باشد.
در این مطالعه میزان بیان زیر واحد β_۱ پمپ Na⁺/K⁺/ATPase، در گروه هایی که آلدوسترون به آنها در روز چهارم کشت جنینی افزوده شده بود چه در تخمک های منجمد (Vit-D4) و چه در تخمک های تازه (D4)، به طور معنی داری بیشتر از گروه های کنترل آنها بود. همان طور که در سایر مطالعات نشان داده شده است زیر واحد β_۱ پمپ Na⁺/K⁺/ATPase، جهت شکل گیری بلاستوسیست در موش ضروری بوده است ]۱۸۱[. همچنین در همین مطالعه نشان داده شده است که بیان ژن Na⁺/K⁺/ATPase، درست قبل از تشکیل بلاستوسیست، به طور معنی دار افزایش می یابد که احتمالاً این افزایش با تشکلیل حفره بلاستوسل در ارتباط می باشد. همچنین در مطالعات دیگر نشان داده شده است که آلدوسترون موجب القای ژن Na⁺/K⁺/ATPase می گردد که با توجه به نقش موثر این پمپ در روند تشکیل بلاستوسیست و تفریخ (زیرا در اثر افزایش فعالیت پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در مرحله تفریخ، حجم مایع داخل بلاستوسیت افزایش یافته و منجر به پاره شدن لایه زونا پلوسیدا می گردد)، احتمال می رود افزایش بیان Na⁺/K⁺/ATPase با افزایش میزان تفریخ در گروه های مذکور در ارتباط باشد. یک احتمال برای عدم افزایش بیان پمپ Na⁺/K⁺/ATPase در تخمک هایی که در مرحله IVM به آنها آلدوسترون افزوده شده بود، چه در تخمک های منجمد و چه در تخمک های تازه، این می تواند باشد که احتملاً بدلیل وجود فاصله زمانی بین زمان افزودن آلدوسترون به محیط کشت (مرحله IVM)، و زمان بررسی بیان پمپ Na⁺/K⁺/ATPase (روز هشتم کشت جنینی)، میزان بیان پمپ مذکور در این گروه ها افزایش معنی داری را نشان نداد، اگرچه افزایشی اندک نسبت به گروه های کنترل مشاهده گردید.

بر اساس نتایج مطالعه حاضر، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمکهای منجمد شده در مرحله GV و نیز افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی، به محیط کشت جنینهای حاصل از تخمکهای منجمد- ذوب شده، در مقایسه با گروه های کنترل که آلدوسترونی دریافت نمی نمایند، موجب تفاوت در میزان تسهیم تخمکها، میزان بلاستوسیست در روزهای ۶، ۷ و ۸ و نیز افزایش معنیداری در میزان تفریخ جنینها در روز ۸ گردید. در این رابطه، به نظر می رسد اثرات سوء انجماد تخمک بیش از تأثیرات مطلوب آلدوسترون بر ژن Na⁺/K⁺/ATPase و متعاقباً بیان پروتیین مذکور باشد. علاوه بر این، در این مطالعه فقط به بررسی تاثیر آلدوسترون بر پمپ Na⁺/K⁺/ATPase پرداخته شده است، لیکن به نظر میرسد آلدوسترون تاثیرات دیگری نیز بر تخمک و یا جنین های گوسفندی داشته باشد که بر روند تکامل آنها موثر بوده و میبایست در مطالعات آتی بررسی گردد.
در مطالعه حاضر، به دلیل کارآیی پایین انجماد تخمک های گوسفندی در مرحله MII، که حتی با افزودن آلدوسترون قبل از انجماد نیز تغییر محسوسی در راندمان انجماد حاصل نگردید، این گروه آزمایشی در همان مراحل ابتدایی مطالعه حذف گردید.
نتیجهگیری:
بر اساس نتایج مطالعه حاضر، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمکهای غیر منجمد موجب افزایش میزان تفریخ بلاستوسیست ها در روز ۸ کشت جنینی و تعداد کلی سلول ها، نسبت به گروه کنترل گردید، لیکن تفاوت معنیداری در درصد بلاستوسیستها نسبت به گروه کنترل دیده نشد. علاوه بر این افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی (D4)، به محیط کشت جنینهای تخمکهای غیر منجمد، موجب افزایش معنی دار میزان تفریخ بلاستوسیست ها در روز ۸ کشت جنینی و تعداد کلی سلول ها، نسبت به گروه کنترل گردید.
بر اساس نتایج مطالعه حاضر، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمکهای منجمد شده در مرحله GV موجب افزایش میزان تفریخ بلاستوسیست ها در روز ۸ کشت جنینی و تعداد کلی سلول ها، نسبت به گروه کنترل گردید و نیز افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی، به محیط کشت جنینهای حاصل از تخمکهای منجمد- ذوب شده، در مقایسه با گروه های کنترل که آلدوسترونی دریافت نمی نمایند، موجب تفاوت معنیداری در میزان تسهیم تخمکها، میزان بلاستوسیست در روزهای ۶، ۷ و ۸ نگردید، ولی افزایش معنیداری در میزان تفریخ جنینها در روز ۸ دیده شد. در این رابطه، به نظر می رسد اثرات سوء انجماد تخمک بیش از تأثیرات مطلوب آلدوسترون بر ژن Na⁺/K⁺/ATPase و متعاقباً بیان پروتیین مذکور باشد. علاوه بر این، در این مطالعه فقط به بررسی تاثیر آلدوسترون بر پمپ Na⁺/K⁺/ATPase پرداخته شده است، لیکن به نظر میرسد آلدوسترون تاثیرات دیگری نیز بر تخمک و یا جنین های گوسفندی داشته باشد که بر روند تکامل آنها موثر بوده و میبایست در مطالعات آتی بررسی گردد.
در مطالعه حاضر، به دلیل کارآیی پایین انجماد تخمک های گوسفندی در مرحله MII، که حتی با افزودن آلدوسترون قبل از انجماد نیز تغییر محسوسی در راندمان انجماد حاصل نگردید، این گروه آزمایشی در همان مراحل ابتدایی مطالعه حذف گردید.
پیشنهادات:
با توجه به تأثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنینهای حاصل از تخمکهای غیر منجمد، به نظر میرسد بتوان با به کارگیری سایر روشهایی که باعث کاهش آسیبهای ناشی از انجماد میگردند، مانند تثبیت غشای میکروتوبولها و ارگانلهای داخل سلولی، استفاده از آنتیاکسیدانها، استفاده از موادی که موجب کاهش سخت شدن لایه زوناپلوسیدا پس از انجماد میگردند همراه با آلدوسترون، موجب ارتقای کیفیت تخمکهای منجمد شده گردید. لازم به ذکر است با توجه به مطالعاتی که بیانگر کاهش سایر ترنسکریپتها پس از روند انجماد تخمک میباشند، میتوان با ارزیابی مناسب، القا کننده ژن ترنسکریپتهای مذکور را تهیه و به منظور جبران مقادیر ترنسکریپت کاهش یافته، در روند انجماد تخمک مورد استفاده قرار داد.
منابع:
۱٫Agarwal, M. K., 1976, Identification and properties of renal mineralocorticoid receptor in relation to glucocorticoid binders in rat liver and kidnev, Jour.Biochemcal,vol. 154 ,p. 567-575.
۲٫Anderson, R., ., 2008, Ovarian cryopreservation for fertility preservation: indications and outcomes, Jour.Reproduction,vol. 136(6), p.681-689.
۳٫Baldassare, H., Furnus, C. C., Matos, D. E., Pessi, D. G., 1996, In vitro production of sheep embryos using laparoscopic folliculocentesis: alternative gonadotrophin treatments for stimulation of oocyte donors,Jour. Theriogenology, vol.45,No.3, p.707-717.
۴٫Barcroft, L.C., Offenberg, H., Thomsen, P., Watson, A.J., 2003, Aquaporin proteins in murine trophectoderm mediate transepithelial water movements during cavitation,Jour. Dev. Biol., vol.256, p.342–۳۵۴٫
۵٫Bavister, B., 2002, Timing of embryo development. Assessment of Mammalian Embryo Quality,Jour. Kluwer Academic Publishers,p. 139-155
.
۶٫Beguin, P., Wang, X., Firsov, D., Puoti, A., Claeys, D., Horisberger, J. D., Geering, K., 1997. The subunit is a specific component of the Na, K-ATPase and modulates its transport function,Jour.Embo,vol.16, p. 4250–۴۲۶۰٫
۷٫Berlinguer, F., Loeni, G., Bogliolo, L., Pintus, P. P. , Rosati, I., Ledda, S., Naitana, S., 2004, FSH different regimes affect the developmental capacity and cryotolerance of embryos derived from oocytes collected by ovum pick-up in donor sheep,Jour. Theriogenologt, vol.61,No.7-8,p. 1477-1486.
۸٫Bertorello, A. M., Ridge, K. M., Chibalin, A.V., Katz, A.I., Sznajder, J.I., 1999, Isoproterenol increases Na/K-ATPase activity by membrane insertion of alpha subunits in lung alveolar cells, Jour.Am. J. Physiol.,vol. 276,p. 20– ۲۷٫
۹٫Betts, D. H., Barcroft, L. C., Watson, A. J., 1998, Na/K-ATPase-Mediated86Rb⁺Uptake and Asymmetrical Trophectoderm Localization of α۱ and α۳ Na/K-ATPase Isoforms during Bovine Preattachment Development , Jour.Dev. Biol.,vol. 197,p. 77–۹۲٫